如何在 AAW™ 自动移液工作站上自动化 SMC^®免疫测定

本规程详细介绍了如何使用 AAW^™ 自动移液工作站自动进行 SMC^® 超灵敏免疫测定。自动化可减少操作时间，同时确保检测的稳健性和重现性。请参阅下面的详细信息和数据。

自动化和 SMC^® 检测所需材料

试剂

选择您的 SMC^® 检测试剂盒。在 AAW™ 自动测试工作站上验证的 SMC^® 检测实例包括：

样品制备实验室器皿

硬件和仪器

除上述内容外，该协议还使用了 Opentrons Flex™ Heater-Shaker - 获取报价。

实验室用具

• 96孔V型底板（Prod.编号AXYP96450VCS)
• SMC^®384孔板（参考试剂盒说明书）
• NEST 12 孔 15 mL 储液器（Opentrons^® Prod.产品编号 99900076）
• NEST 2 mL 96 孔板（Opentrons^® Prod. No. 99900103）
• 球形磁力板（Opentrons^® Prod.90-0003-02, 随 BioTek^® 405™TSUVS 洗板机提供）
• Opentrons^® 50 μL 吸头架，过滤型（Prod.No. 99100104)
• Opentrons^® 1,000 μL Tip Rack, Filtered (Prod.No. 99100106）
• 铝制粘板密封件（Fisher Sci Prod.SLGPR33RS)
• 5ml  Luer-Lok™注射器 （Fisher Sci Prod. No. 14-829-45）
• 0.2um 注射过滤器 (Prod. No. SLGPR33RS)

为 SMC^® 检测准备 AAW™ 工作站

AAW™工作站用于自动化 SMC^® 免疫测定。实验方案被改编成 Python 代码，导入 Opentrons^® 应用程序和工作站。仪器执行所有液体处理步骤，包括标曲梯度稀释、台上振荡和磁珠沉降。使用用于 SMC^® 和 MILLIPLEX^® 技术的 BioTek^® 405™TSUVS 洗板机在平台外进行洗板。（产品货号：95-0004-06）。要为 SMC^® 检测准备仪器：

1. 从 Millipore^®协议库中下载SMC^®试剂盒协议文件，并加载到计算机上的Opentrons^®应用程序中。然后可通过 "发送至 Opentrons FLEX "或"启动设置"功能将协议发送至 AAW™ 机器人。
2. 加载在应用程序或 AAW™ 触摸屏中列出的所需模块和移液器。将 Opentrons FLEX™ 加热器-振动台装入台面插槽 D3。
3. 一旦协议发送到机器人，可通过选择协议和"Start Set-up"按钮启动实验。将显示一个参数列表，在此可进行如下具体参数选择：
   1. 多通道安装：左侧（默认）或右侧
   2. 检测抗体：感兴趣的 SMC^® 检测试剂盒（16 个选项）
   3. 运行类型：可运行标准曲线 + 样品（默认）或仅标准曲线
   4. 干运行：开或关（默认），用于缩短孵育和洗涤步骤的测试运行
   5. 捕获步骤的封板：开或关（默认），用于在捕获步骤前手动封板的选项。否则，检测将在板设置后立即进入捕获步骤。
   6. 稀释样品：开或关（对于原始样品，默认为关）
   7. 稀释比例：如果选择样品 + 稀释样品，则输入 2（默认）
      注意：如果需要其他样品稀释比例（1:3-1：1,000），请在运行 SMC^® 协议之前运行 SMC^® 样品稀释协议
   8. 样品数量：输入 1-20 个样品
4. 建议在 AAW™ 工作站上运行一次模拟程序，以熟悉检测步骤。试运行可在无液体或有水/缓冲液的情况下进行。干运行缩短了混合和孵育步骤，并具有将吸头送回架子的功能，便于进一步练习。
5. 在开始运行之前，必须按照触摸屏上或 Opentrons^® 应用程序中的步骤说明，至少进行一次实验室器皿位置检查。一旦确认了实验室器皿偏移量，AAW™ 工作站就会存储这些值，供以后运行时使用，除非需要，否则无需重复。实验室器皿位置检查可在试运行期间使用空的实验室器皿，也可使用试剂准备就绪的实验室器皿。

SMC^® 高灵敏度试剂盒设置步骤

 SMC^®免疫测定是根据产品说明书手动进行的，或使用 AAW™ 工作站上的调整协议进行的（见下文）。在这项应用研究中，SMC^®检测在 AAW™ 工作站上重复进行了 3 次。除了在 BioTek^® 洗板机上进行的清洗步骤外，所有检测步骤都在仪器平台上进行。所有检测均在 SMCxPRO^® 仪器上读取，并通过 xPRO^® 软件获取数据。所需实验器皿和材料的产品清单见上文。

试剂制备

注：试剂根据每个 SMC^® 试剂盒的说明书制备。

1. 使用前将所有试剂加热至室温 (RT)。
2. 避光保存检测抗体，直到捕获后洗涤后准备使用。触摸屏指示将提示何时稀释检测抗体。
3. 准备 1X 洗涤缓冲液（来自 10X 洗涤缓冲液）。
4. 在旋转器上或手动反复移液混合抗体包被磁珠。
5. 如图 1 或 AAW^TM 工作站触摸屏所示，将试剂加入“标准+样品”和“试剂储存板”。
   1. 在方案启动时，可在 Opentrons^® 应用程序或 AAW^TM 触摸屏中找到精确体积。
   2. 只有在本方案中以 1:2 稀释运行稀释样品时才需要样品稀释液，否则，请在本检测前运行 SMC^® 样品稀释方案。

注意：如果仅运行标准方案，可在下面的小贴士和技巧部分找到容量。

样品制备

使用以下方法之一制备样品：1）使用前立即以 13,000 x g 离心 10 分钟；或 2）如果使用带滤膜的过滤板：将过滤板叠放在 96 孔 V 型底贮样板上。将 400 µL 样品放入滤板孔中，以 1,100 x g 转速旋转 ≥ 10 分钟。若采用原液或1:2稀释方式，样品可按照图1所示方式加入试剂板。如果需要其他样品稀释，请使用 SMC^® 样品稀释协议或在运行 SMC^® 检测前手动稀释样品。样品稀释协议可在 Millipore^® 协议库 网页上找到。

机器人平台配置和检测协议

准备好所有试剂和样品并添加到相应的孔中之后，就可以在 AAW™ 工作站上设置平台布局了。平台布局如图 2 所示。

1. 在板位 A1 和 B1 中装入 2 盒 50 µL 吸头。
2. 在板位 A2 中装入一盒 1,000 µL 的吸头。
3. 在 B2 中装入 NEST 12 槽样品池。
4. 在板位C2装入磁力板
5. 在 D1 中装入 SMCxPRO^® 384 孔读取板（不带盖）。
6. 在 D2 中装入 NEST 2 mL 96 孔试剂板。
7. 将 96 孔 V 底检测板装入加热器-振动器 (D3)。

1. 一旦所有实验器皿和试剂都放置在正确位置，就可以关闭机器门。如果已激活开始设置 功能并选择了参数，则可通过选择蓝色运行箭头开始实验。实验工作流程见图 3。

2. 对于检测抗体步骤，在洗板的同时，按照试剂盒说明制备检测抗体，并将稀释的检测抗体溶液转移到 NEST 12 孔槽的第 5 孔中。
3. 继续按照 AAW^™ 工作站触摸屏的指导步骤进行检测和洗脱/转移步骤。在机器检测抗体孵育和洗脱孵育步骤之前，会有暂停时间，以便用铝封条手动密封平板。孵育步骤结束后，按照触摸屏上指示的时间返回。
4. 一旦方案完成，将平板支架（板底盖）添加到平板底部，并使用平板滚筒用铝质粘合剂板封牢固地密封读取板。在室温以1100 x g，1分钟离心读取板。
5. 从密封的读数板上取下板拖，将其装入 SMCxPRO^® 免疫测定系统。开始读板。

自动化 SMC^® 检测 vs 手工检测结果

AAW^™工作站上的自动 SMC^® 程序在六种不同的 SMC^® 试剂盒上进行了验证，包括 IL-6、cTnI、IL-17A、IL-22、IL-23 和 IL-17F。在工作站上运行三次重复检测，并与手工结果进行比较。在 AAW™ 仪器上的每次运行中，每次 IL-6 检测的定量下限 (LLOQ) 都低于已公布和人工定量下限0.077 pg/mL，平均去除 2 个异常值（图 4）。cTnI 的最低定量限（LLOQ）结果显示，在三次实验中有两次与已发表的 LLOQ 值 0.694 pg/mL 相符。虽然有一次运行略高于该阈值，但与人工检测的 LLOQ（1.39 pg/mL）相等。在 IL-17A 检测中，所有自动测试结果均低于公布的 0.069 pg/mL 的 LLOQ（图 4），平均每次检测去除 1 个异常值。与人工检测相比，所有自动检测去除的异常值较少。总体而言，这些结果表明，自动测定在所有测试参数方面的表现都是可靠和一致的，结果汇总于表 1。

同样，IL-22、IL-23 和 IL-17F 三项检测在每次自动测试运行中均达到或优于其公布的 LLOQ（图 5）。每项检测的异常值平均数量分别为 0、~1 和~3，比人工检测 2、3 和 6 个/次的表现更低。表 1 也汇总了这些结果。这些检测结果证实，AAW^™ 自动化提高了可重复性和一致性，同时仍能保持较高的检测性能和稳健性。

人工检测（n=5）和自动检测（n=4）获得的 IL-6 LLOQ 的比较进一步突出了检测的可重复性（图 6）。与人工检测相比，AAW™ 工作站的标准偏差在统计学上有所降低（p<0.05）。最后，使用 IL-6 SMC^® 试剂盒比较了健康血清和血浆样本的人工和自动测试性能（图 7）。样本相关性结果证实，AAW^™工作站的性能与人工一样好，R 方值为 0.9915。

最后，比较同一 SMC^® 检测在不同工作站上的表现证明了自动化方案的稳健性。AAW™ 工作站 1 和工作站 2 的结果表明标准曲线重叠，具有相同的 LLOQ（图 8A）。此外，两台仪器上标准曲线的相关性很高，R²值为 0.9966（图 8B）。

摘要

AAW™工作站是一种自动液体处理机器，具有友好的用户界面，能够执行高通量的技术工作流程，让您有更多的时间放手工作。在 AAW™ 工作站上执行 SMC^® 检测的关键液体处理和孵育步骤的自动化方案已经开发出来。除洗涤步骤外，所有检测步骤均在工作台上进行。AAW™ 工作站在三次运行中都能达到或优于手工操作的 LLOQ，其 %CV 与经验丰富的用户手工操作的 %CV 相近或更好。

请在下方索取有关 AAW™ 工作站的更多信息。

小贴士和技巧

• 建议在 AAW™ 工作站上进行试运行，以熟悉检测步骤。试运行可在无液体或有水/缓冲液的情况下进行。干运行缩短了混合和孵育步骤，并可将吸头放回架上供进一步练习。
• 如果在吸液步骤中吸头没有位于孔的中心，请重新检查实验室器皿位置检查以确保位置正确。
• 如果只运行标准曲线样本板，您可以从吸头盒行（D-H）移除不必要的吸头，以用于微珠分配（1,000 μL 吸头架，第 12 列）、检测分配（1,000 μL 吸头架，第 11 列）和洗脱/转移步骤（50 μL 吸头架，第 1-12 列），从而最大限度地减少试剂浪费。
• 只进行标曲检测的干运行所需要的最小试剂体积为：6 mL 1x 微珠、2.5 mL 1x 检测、2 mL 洗脱缓冲液 B 和 2 mL 缓冲液 D。
• 建议在 AAW™ 自动测试检测和洗脱孵育步骤上使用铝板密封。保持标签上的位置并折叠到平板边缘。