从容应对
高难度Western Blotting

提高低丰度蛋白WB检测成功率，我们已经之前的推文中分享了三个锦囊：

（1）通过有效的样本制备提高目的蛋白的丰度，

（2）正确选择转印膜改善低丰度蛋白和荧光检测效果，

（3）优质抗体是Western Blotting成败的关键。

这次，我们将就封闭、增强检测信号以及HRP底物的选择等方面介绍低丰度蛋白WB检测的黑科技。

即用型小分子封闭液：

稳定输出好结果

WB中封闭膜上未结合蛋白的区域是防止抗体非特异结合、产生高背景的必要手段。传统的牛奶/蛋白类封闭剂会形成较厚的、粘粘的蛋白层，因此：

1、导致与抗体发生非特异性相互作用，增加了背景；

2、不适合做蛋白磷酸化检测，因为牛奶中本身含有的磷酸化蛋白会干扰检测。

举个例子：

牛奶在膜上形成厚厚的一层蛋白，与抗体的非特异性结合导致整体高背景。Bløk^®封闭剂仅在膜上 形成很薄的一层化学分子层，不会与抗体结合，背景较低。

荧光检测是WB新的发展方向，而磷酸化蛋白的荧光检测是比较有挑战的。除了必须选用 低荧光背景的Immobilon^®-FL荧光检测专用转印膜（目录号IPFL00010）以外，避免封闭剂带来的困扰也很重要。

● 脱脂奶中含的酪蛋白是磷酸化的，与磷酸化抗体结合造成高背景；

● 脱脂奶中的成分可能导致孵育时目的蛋白脱磷酸化，所以最好改用磷酸酶抑制剂及非蛋白类封闭剂相结合的Bløk^®-PO小分子封闭剂。

● Bløk^®-CH为通用型， Bløk^®-PO为磷酸化蛋白专用型，非磷酸化蛋白的荧光检测建议采用Bløk^®-FL。

信号增强试剂：

挽救哪些难以检出的低丰度蛋白

Immobilon^®免疫信号增强剂专用于信号强度较低的Western免疫印迹。这种即用型试剂兼具信号放大和封闭功能，可通过增强抗体-抗原反应，使产生的信号强度比传统试剂强2-10倍。该试剂适用于传统免疫检测或SNAP i.d.^®加速器的膜封闭和抗体稀释步骤。Immobilon^®信号增强剂可兼容PVDF和硝酸纤维素印迹膜，适用于显色法、化学发光法和荧光检测方法。对于信号足够强，但一抗珍贵且有限的情形，使用Immobilon^®信号增强剂可减少一抗用量。

● 促进抗原抗体特异性结合，免疫信号显著增强；

● 大幅提高低丰度蛋白的检测成功率；

● 节约抗体达90%（一抗和二抗）；

● 荧光检测及磷酸化蛋白检测也适用。

检出的同时减少抗体使用量

● 促进抗原抗体特异性结合，免疫信号显著增强；

● 大幅提高低丰度蛋白的检测成功率；

● 节约抗体达90%（一抗和二抗）；

● 荧光检测及磷酸化蛋白检测也适用。

HRP底物：选择性价比最高的

化学发光HRP底物 ( 辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂 ) 是目前WB检测中最为灵敏的试剂。Immobilon^®系列HRP底物有多种选择，包括3种不同灵敏度级别的预混型，以及2种超敏型，研究者可根据具体实验要求选择性价比最高的一款。

选用灵敏度更高的HRP底物获得更好的数据，同时带来三重效益：

● 更佳的结果：产生更强的条带信号便于进行定量印迹检测（比较抗体同为 1:10,000 稀释度时 Immobilon^® Crescendo 和Forte底物所获得的不同条带强度）；

● 更快：仅需10min洗去原有底物换上新底物进行反应，比重新用2.5hr进行优化抗体孵育再显色省事得多；

● 更便宜：HRP底物的费用远远低于抗体的费用

Immobilon^® HRP底物与 Immobilon^®免疫信号增强试剂配合使用，可以相应增加各级底物的检测灵敏度