重组蛋白表达
的正确打开方式！

什么是重组蛋白表达？

早在1970年代，科学家们就发现一系列酶可以使DNA发生剪切作用，而后研究者们利用该现象首次提出了重组DNA的概念，即将感兴趣的基因片段插入到细菌的DNA中。 
而重组DNA经表达后产生的重组蛋白被广泛用于各个领域，包括靶蛋白功能研究、疫苗研发生产、基因诊断、食品研究等。
是的，重组蛋白的表达在经历了多年的技术发展革新后已经成为各个实验室常用的蛋白研究工具之一，而重组蛋白表达过程中需要利用合适的表达系统，常见的表达系统主要有原核细胞(E.Coli)、真核细胞表达系统(昆虫细胞sf9、High Five，哺乳动物细胞HEK293、CHO以及酵母等)。

如何做好重组蛋白表达？

在实际应用过程中表达系统的选择以及优化对于特异的蛋白来说至关重要。随着转染试剂盒以及细胞培养技术的发展，如今蛋白表达已经变得相对简便和经济。
尽管如此，在涉及大规模高通量蛋白表达筛选以及对于表达水平低，表达困难的特殊蛋白时，传统的表达方法仍然具有一定的局限性。

给你支招-无细胞合成/表达系统

无细胞合成/表达系统(Cell Free Protein Synthesis/Expression (CFPS/CFPE) system，以下简称CFPS)在一定程度上可以弥补传统表达方法的缺陷。简单地说，无细胞合成/表达系统突破了原来的细胞环境的限制，基于非细胞体系将复杂的蛋白表达过程简化为转录翻译的过程，利用细胞裂解液中的细胞器在一定的溶液体系中表达目的重组蛋白(Fig 2.)。
而早在20世纪70年代，科学家们就提取小鼠骨髓瘤细胞中的免疫球蛋白轻链mRNA作为模板，利用兔红细胞裂解液成功在体外表达免疫球蛋白轻链(Stavnezer & Huang, 1970)。

此后，越来越多的商品化试剂盒用于无细胞表达，研究者发现利用早先的原核细胞提取物进行蛋白表达时部分真核蛋白在该系统中不可溶，因此不久，不同细胞类型的试剂盒被开发出来，包括小麦胚芽细胞、Leishmania tarentolae、兔红细胞、昆虫细胞、植物细胞以及人源细胞等，用户则可以根据自身的需要选择不同的细胞种类。

CFPS在实际应用中的优势在哪?

CFPS在实际应用过程中表现出一定的优势，例如小麦提取物可用于大分子目的蛋白的表达，在小麦提取物中不含内源mRNA，减少了其他非目的蛋白的表达，提高了表达产物的纯度；此外由于目的蛋白来源于真核细胞提取液，同时也保证了其构象和功能的完整，包括糖基化等修饰也得以保留。

如今，高通量筛选已经成为科研和工业领域内常见的技术手段之一，蛋白表达领域内也经常使用大规模表达不同重组蛋白的方法达到实验目的。

例如丙氨酸筛选(Alanine scanning)，研究者们可将目的蛋白中的全部或部分氨基酸分别突变成丙氨酸后研究其功能影响(Fig 3，Schomer et al., 2019), 然而利用传统方法表达大量不同的重组蛋白时需要耗费大量的人力物力，包括细胞培养所需的时间、摇床占用的空间、昂贵的培养基成本以及繁琐的实验操作等。于是，CFPS产生了！

CFPS可以将表达时间由4-5天甚至几周缩短至9小时以内，由PCR产物开始，省去了密码子优化等，操作简便无需添加人工脂质体以及使用转染试剂盒等。此外，CFPS还可用于表达毒性蛋白，利用传统的方法过表达毒性蛋白时可能会破坏细胞从而影响蛋白的折叠和功能，降低蛋白产量。

CFPS的适用领域在哪?

1.膜蛋白表达领域
膜蛋白在人体内行使着重要的生理功能，超过50%的小分子药物靶向离子通道(Ion channel)以及G蛋白偶联受体(GPCR)，然而传统方法表达膜蛋白对细胞膜具有一定的损伤，产量较低，并且利用去污剂从细胞膜上抽提膜蛋白时可能会进一步损失蛋白并且对蛋白的稳定性有一定的影响，而利用CFPS可以直接在溶液中引入合适的去污剂，使蛋白表达在过程中直接被去污剂稳定从而提高蛋白的稳定性和产量。

2.蛋白质结构生物学研究领域
除此之外，CFPS还可广泛应用于蛋白质结构生物学研究，由于结晶法解析结构对蛋白质量要求较高，尤其是野生型(Wild type)膜蛋白稳定性较差，蛋白产量较低，因此在蛋白优化过程中需要筛选大量的表达载体(Construct)，包括突变体、截短体等从而获得高质量蛋白样品(Fig 4, Munk et al., 2019)，而借助CFPS则可在短时间内筛选大量的表达载体，获得高质量的样品进行结构解析。

除了早期的蛋白筛选之外，对蛋白质结构或计算生物学领域(蛋白质结构预测)中关键相互作用的验证同样需要表达大量重组蛋白，而CFPS则可提供稳定且高效的蛋白表达。此外，在CFPS反应体系中可简便地引入特异性标记的氨基酸(如同位素15N、13C等)可用于蛋白质免疫检测以及研究蛋白质相互作用等，并且在蛋白质合成过程中加入硒代甲硫氨酸等可利用特征信号进行蛋白相位的解析。

给你神器 -默克无细胞表达试盒

默克可提供CFPS700 kit以及ALiCE®两种无细胞表达试剂盒，分别利用小麦胚芽提取物以及植物细胞裂解液作为蛋白合成反应体系。两种试剂盒均可用于多种蛋白的表达：

CFPS700 kit
其中包含NTP混合物、RNA 聚合酶、转录缓冲液、 DTT、小麦胚芽提取物、氨基酸混合物，用户只需利用相应的引物按照标准步骤进行简单的PCR等操作，即可在最快9 h内收获目的蛋白，并且中间过程易于操控。ALiCE®可用于含多种翻译后修饰的蛋白表达(糖基化、二硫键等)，保证蛋白的功能。

特点和优势:
1.已验证可表达多种原核和真核蛋白，包括有毒蛋白
2.从PCR产物开始-无需克隆和细胞培养
3.不需要优化密码子，即使A/T或G/C高含量的transcripts也适用由于其天然结构和真核生物来源，蛋白溶解度高
4.无动物成分，无血清
5.可线性扩大产量
6.可诱导形成二硫键
7.低成本，平均每个反应产出10ug蛋白，每个试剂盒提供50个反应

ALiCE® kit
其中包含ALiCE®裂解液和两种pALiCE载体(Fig 5)，用户可根据需要选择相应的载体，其中pALiCE01载体可用于相对易表达并且无翻译后修饰的蛋白，而pALiCE02载体包含特定的信号肽，可将表达后的蛋白定位到相应的细胞器其中进行翻译后修饰。

用户在使用ALiCE®试剂盒的过程中只需简单一步法，将构建的质粒与预混溶液混合孵育(Fig 5)，在25°C室温条件下反应48小时，即可获得高达3 mg/ml目的蛋白，而载体上带有的纯化标签(Strep、His)可用于进一步蛋白纯化。此外用户还可根据表达规模选用ALiCE® Tube或96孔板进行表达。

特点和优势:
1.价格合理，但蛋白质产量高出30倍
2.技术经过500多种蛋白质的反复验证
3.工作流程经过简化，只需极少的操作即可开始反应，并且包含的去污剂有助于轻松回收蛋白质(包括微粒体中的蛋白质)

常见问题：

我的蛋白适不适合使用CFPS表达？
目前CFPS已成功表达13,364种人源蛋白，包括酶、GPCR、离子通道、蛋白多聚体复合物、毒性蛋白等。

默克提供的两款kit可用于抗体表达研究吗？
由于抗体中含有二硫键，可选用ALiCE® kit中的pALiCE02载体进行反应，可获得含二硫键修饰的蛋白。

如何确保使用ALiCE® kit收获超高产量蛋白？
首先可以尝试使用对照质粒做表达，由于pALiCE载体中含有eYFP基因，可根据表达后溶液的颜色观察表达量是否正常，理论上48小时候溶液可观察到明显呈黄色状态，否则可以检查试剂盒是否过期、试剂盒储存条件等。另外尝试在质粒制备过程中加入RNase抑制剂以及控制DNA浓度为1-20 nM。同时避免高温、机械力等对反应体系的损伤。