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Duolink^®技术问答

Duolink^®PLA技术已被世界各地的科学家用于检测蛋白表达、蛋白互作和蛋白后修饰等研究, 目前使用该技术已发表近千篇文章, 涵盖了癌症研究、细胞生物学、神经生物学、干细胞研究、表观遗传学、胚胎学、发育生物学和免疫学等多个研究领域。

今天，我们梳理了大家最关心、最容易犯错的几个问题，请大家拿起小本本赶紧记好哦。

1.Duolink^®实验能检测到两个蛋白的最近和最远距离是多少?
两个目标抗原(表位)的空间距离在40nm以内就会产生PLA阳性信号, 是目前最具操作性和精确性的蛋白互作研究方法。

2.用Duolink^®实验能对没有固定的样品进行体内检测吗?

Duolink^®是针对固定化的细胞和组织进行的优化方案。在活细胞中Duolink^®试剂中的酶和DNA可能会变质或被破坏。

3.进行一次 Duolink^®实验，要订购哪些试剂?

一次完整的 Duolink^®实验，需要以下试剂：两个一抗(识别目标蛋白)、一对PLA探针(根据一抗的生物来源进行选择)、检测试剂(明场或不同荧光基团标记)、封片剂、洗涤缓冲液。

 4.Duolink^®实验需要的细胞或组织的最小和最大样本量是多少？

a）细胞样本：原则上，Duolink^®需要的最小样本量为一个细胞，在实际应用中还需要考虑细胞类型或特殊的实验要求；最大样本量难以界定，但如果细胞密度过高，抗体或其他试剂难以到达样品中心的细胞。

b) 组织样本：没有最小要求，但根据R&D部门的经验，成功分析的组织切片最厚达到30μm。在实际的实验中，样本需要量还需要考虑组织类型和前处理的方法(如固定、透化、抗原恢复等)。

5.Duolink^®实验中，最关键的步骤有哪些?

a)一抗的选择:一抗应该是IgG类型、亲和纯化、特异性高的单抗或多抗。选择经过IHC或IF验证的一抗，可以大大提高Duolink^®实验的成功率。

b)一抗的优化: Duolink^®实验适用于多种细胞和组织样品，为了确保您的一抗适用于选择的样品，建议对选择的一抗进行条件优化，包括:一抗的工作浓度、兼容的样品前处理方法(固定、抗原恢复、透化等)、封闭液和释液配方等。

c)样品前处理:实验前需要对样品进行充分的前处理，包括:固定、抗原恢复、透化处理等，由于不同的前处理方法和试剂配方可能会影响一抗的效果，需要对不同一抗的进行条件优化。经过IHC验证的一抗，可以使用IHC实验中相同的前处理方法等条件。

d)对照:为精确评估实验结果，建议同时设置生物学和技术性对照，如生物学阴性对照:明确不表达一种或两种目的蛋白的样本，可检测一抗特异性;技术性阴性对照:不使用一抗，排除背景信号。

6.Duolink^®实验过程中能否停止操作?

实验操作过程中，有两个步骤可以暂停：

a）一抗孵育时间可以1.5小时至过夜灵活选择；

b) 根据荧光检测或HRP检测方法不同，可以停顿的地方有所差异：荧光法检测，最后洗涤之后和封片之前，需要室温风干玻片，该过程可以过夜进行。封过的片子可以在4℃避光保存4天，-20℃保存数月。HRP检测：封片后需要晾干，通常可以过夜进行。

7.如果我的一抗不是来源于小鼠、兔或山羊，或两个一抗来自相同的种属，还能用于 Duolink^®实验吗?

能。我们提供Duolink^® In situ Probemaker kit，允许客户可以将PLA寡核苷酸正或负探针偶联到感兴趣的抗体上，如此制备的PLA探针可配合使用Duolink^®试剂进行目的蛋白的检测。

8.PLA号多大?观察时应该选择什么物镜?

PLA信号是清晰、点状的信号，直径大约500nm，观察时至少选择20X物镜，有时需要40X物镜。

9.PLA值号可持多久？如何保存片子才能保持PLA号？

强烈建议使用 Duolink^® mounting medium，其优化的配方可有效保持PLA号，因为研究发现使用其他封片剂时，PLA号会褪色，有时甚至在短时间内淬灭。

使用 Duolink^® Brightfield Mounting Medium的片子可以室温保存，PLA信号可保持数年。使用 Duolink^® Mounting Mediu with DAPI的片子，成像前可避光保存12-18小时，未封片的片子可-20℃避光保存一周，如用透明指甲油封闭盖玻片四周，可-20℃至少保存半年。

经过成像分析的片子，激光会使信号稍微褪色，因此在使用多孔板进行 Duolink^®实验时，请选 Duolink^® In Situ Microplate Nuclear Stain and Anti-fade，防止光照射引起的不同孔样品间的误差。

以上Tips大家都记好了吗？