CRISPR
体内递送的研究进展！

摘要：火热的CRISPR基因编辑技术，CRISPR/Cas9系统在基础研究和临床转化中均拥有巨大应用潜力。但是CRISPR/Cas9自身体系庞大、细胞内化效率低、体内半衰期短，使得基因编辑效率大打折扣。

相比于易于导致插入诱变、易致癌，并有免疫原性的物理方法以及病毒载体递送策略，非病毒载体在CRISPR/Cas9递送中展现出明显优势，下面由南开大学的刘阳研究团队为大家介绍相关研究进展。

一、CRISPR/Cas9高效递送困难重重
CRISPR，规律成簇的间隔短回文重复序列，经典的CRISPR/Cas系统由Cas蛋白和单链向导RNA (sgRNA) 两部分构成, 其中最为熟知的当属CRISPR/Cas9系统, 在sgRNA的准确引导下，Cas9蛋白能够准确的对目标序列进行切割，从而实现精确的基因编辑。

然而，要想实现CRISPR/Cas9的高效体内递送，还需克服以下“重重障碍”：
1.CRISPR/Cas9十分“庞大”：该系统质粒尺寸大于7 kb, 通常使用的Cas9蛋白分子量大于160 kDa, 许多递送体系难以承担如此“重荷”
2.CRISPR/Cas9在体内半衰期短，编辑效率受限
3.CRISPR/Cas9难以独自跨越脂质生物膜，到达细胞内效应部位( 细胞质活细胞核 )

二、非病毒载体显神通
相比于以物理方法与病毒载体为基础的递送，非病毒载体在CRISPR/Cas9的递送中显示出优势，其免疫原性低、装载能力高、设计简便，有助于打破困境，实现高效的基因编辑。

1.功能性脂质体
Lipofectamine为广泛使用的商品化脂质体，但是其不具有靶向性，难以在靶细胞/靶器官富集，并具有较高的毒性与免疫原性。
对传统脂质体的改造与功能化为常用策略，在脂质体表面引入功能性配体1，引入可降解化学键2，或与外泌体等稳定且生物相容性良好的材料融合3，为提高脂质体靶向性、降低毒性并提高编辑效率的有效方法，CRISPR/Cas9的体内编辑效率可因此提高至90%以上。

2.聚合物纳米载体
聚乙烯亚胺(PEI)是一类最常用的聚合物基因载体。大量的氨基赋予PEI很高的电荷密度，因此有助于对基因的压缩以及实现溶酶体逃逸。
目前，高分子量的支状PEI( Mw=25 kDa) 已经成为DNA/ RNA递送的黄金标准。然而, 过高的电荷密度虽然有助于提高转染效率, 但同时也增加了聚合物的毒性, 使其体内应用受限。
降低阳离子聚合物的分子量或对其进行化学修饰(例如PEG修饰) 可有效降低毒性，同时转染效率可以通过对低分子量PEI进行氟化修饰4或者苯硼酸修饰5来保证。
此外，交联低分子量PEI以形成与高分子量PEI相似的结构, 从而提高低分子量PEI的电荷密度也可达到保证转染效率、降低毒性的目的6。
若形成交联结构的化学键在细胞内环境可降解, 载体的毒性也随之降低, 这为CRISPR/Cas9的安全、高效递送提供了另一思路。

3.无机纳米颗粒
金纳米颗粒7、金属有机框架8、二维黑磷纳米片9等无机纳米颗粒均被用于递送Cas9蛋白, 此类载体比表面积大、粒径易于控制、胶体稳定性佳, 表现出较高的负载效率以及溶酶体逃逸能力, 成为未来的研究热点。

4.杂化纳米载体
单一类别的纳米载体很难满足CRISPR/Cas9的所有递送需要, 构建多种材料杂化的智能型递送平台成为未来的研究方向。
研究者们开发出一种脂质体-金纳米颗粒杂化纳米体系, 在携带CRISPR/Cas9质粒进入细胞的同时, 借助金纳米粒子的光热效应促使溶酶体破裂, 修饰于金颗粒表面的TAT多肽引导该负载质粒的纳米金进入细胞核, 最终在金纳米颗粒、TAT多肽以及外层脂质体的共同作用下, 该纳米平台实现了高效的基因编辑10。
基于CRISPR/Cas9在基因编辑领域的强大优势, 以及非病毒载体的不断发展, 我们相信在非病毒载体在CRISPR/Cas9的递送将会有更加出色的表现。

三、默克药物递送解决方案
默克提供种类丰富的产品, 助力CRISPR/Cas9及mRNA疫苗的高效递送平台搭建：

1.脂质体制备原料与试剂：大豆卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或修饰DSPE等，加之种类丰富的盐类、溶剂等相关试剂选择，脂质体制备的全流程被完美覆盖

2.聚乙二醇与聚环氧乙烷(PEGs/PEOs)：分子量可选范围宽至数百至十万，线性、枝化、多臂等多种选择也使聚合物研究更为灵活，此外，不同官能团(乙烯砜、苯并环辛炔、生物素等) 修饰的PEG产品为功能性聚合物体系构建提供帮助

3.聚乙烯亚胺(PEI)：数百至数万的分子量范围，线性、枝化结构可选，叠氮、硬脂酸等修饰产品同样带来进一步功能化的丰富选择

4.药物递送纳米颗粒制备试剂盒：基于聚乙二醇衍生物等聚合物材料的NanoFabTx™试剂盒提供更为高效、可控的药物递送载体制备方案