多色流式4大解题思路
师兄师姐不一定告诉你

随着流式细胞仪、单克隆抗体和荧光探针的不断发展，流式分析已经从早期的单激光单色检测，发展到可快速同时定量检测一种细胞的多种特性，多色多参数多激光的检测分析。它为日益复杂的实验打开了新的大门，但也因为要平衡多种因素而造成数据波动和结果不可靠。

别怕，解题思路在此，请查收！

01. 流式细胞应用于哪些领域？

现已被广泛用于免疫学，细胞生物学，血液学、肿瘤学、微生物学等多个领域。典型的应用实例包括血液系统疾病的免疫分型，肿瘤学中细胞DNA的倍体和周期分析，细胞生物学研究中的细胞凋亡，增殖，细胞表面或胞内的抗原检测等。

其中，使用流式抗体进行细胞的分型鉴定是流式技术最为广泛的应用，常见的免疫表型分析实验包括单细胞悬液制备，细胞表面或胞内抗体的染色，上机检测这几个基本的步骤。

02. 常见的流式细胞标记法有哪些？

直接法：荧光标记的抗体直接与细胞的抗原结合，一步孵育后即可以进行细胞的流式上机检测。直接法因为其方便快捷，交叉反应和背景少，是目前最为主流的流式标记手段。

间接法：细胞先与一抗进行孵育，然后荧光二抗再结合到一抗上形成免疫检测复合物，后续即可以进行上机。当商品化的直标抗体无法获得时，间接法可以作为补充，但间接法在多色实验中很难避免种属间的交叉反应，选择性会大大受到影响。

除选择上述两种商品化标记抗体外，还可使用抗体标记试剂盒标记抗体，获取实验所需的荧光标记抗体，但该方法对技术要求高，标记效果往往受多种因素影响。

03. 流式的配色需要综合考虑哪些因素？

多色流式细胞分析需要平衡多个难题的解法，包括仪器配置、抗原表达和染料亮度，以及可用的抗体- 染料组合等等。

• 仪器的配置：抗体所选择的荧光染料必须根据仪器的激光通道以及相应的滤片配置进行选择。

• 抗原的表达量：待测细胞类群的丰度以及荧光染料的亮度。常见的配色原则是将亮度高的染料配给低丰度的抗原或者低丰度细胞上的抗原。

• 荧光标记的抗体的可选择性：从供应商处选择流式验证过的符合配色需求的抗体，如果无法找到合适的供应商，则可以考虑使用荧光二抗进行间接标记，但这种方案可能会造成种属间的交叉反应以及高背景的问题。

如果研究人员无法在一次实验中妥善调和上述因素，就需要退而求其次，进行多次分析。而多次分析难免引入各不相同的实验条件，由此造成的数据波动最终会导致数据结果不可靠。

04. 默克创新型多色流式分析如何帮你解开难题？

ColorWheel^®流式抗体和染料组合采用专为流式细胞术优化的专利技术，支持用户分别选择抗体和染料并根据自身需要任意组合，在保证实验成功率的同时又可帮助简化流式细胞分析流程，突破传统流式分析方案的局限。

主要优势：

• 突破局限：可灵活选择抗体和染料进行搭配组合，解锁多色流式分析的无限可能

• 简化流程：简单三步操作即可制备即用型抗体-染料溶液，实操时间不超过5分钟

• 高效稳定：单克隆抗体兼备高特异性和可重复性，冻干粉形式增强运输和储存稳定性

• 洁净兼容：无防腐剂，兼容的样品类型更广

ColorWheel^®技术基于专利的寡核苷酸配对连接技术将抗体与染料偶联起来（图3），偶联产物与荧光标记的直标抗体保持一致，可以直接用于流式的标记检测。该技术的偶联过程只需要简单的1：1的混合，其偶联过程比起传统的抗体标记方法大大简化。ColorWheel^®流式抗体的选择灵活性能让使用者更加灵活的设计多色方案，摆脱由于抗体荧光组合缺失导致的配色困境。

ColorWheel^®不仅可以简化流式细胞分析流程，突破传统流式分析方案的局限，同时可以保证在多重指标的流式实验中具有优异的表现。

以下实例检测了免疫T细胞检测常用的指标CD3, CD4, CD44, CD45RA，该4重指标的实验用来评估CD4+辅助型T细胞的激活状态。结果显示，ColorWheel^®流式抗体与传统的流式抗体具有同样优异的表现。