默克生命科学主题季|
细胞幼崽培养说明书

细胞培养是生命科学研究的核心部分，培养技术也在不断发展。为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性和可重复性，建立稳定一致的培养环境至关重要。

细胞的培养从消化搜集细胞、接种细胞、细胞生长到细胞的冻存完成整个生命的周期，每个周期都有独特的细胞培养小技巧，细胞培养不再难！

一、胰酶的使用一细胞消化

细胞分离的方法通常分为酶学方法，如使用胶原酶、胰蛋白酶、Accumax™、Accutase®等，以及非酶学消化液，如EDTA、NO-ZYME™、Non-enzymatic消化液等。其中，胰蛋白酶是实验室中通常的用于贴壁细胞消化的酶。

胰蛋白酶适用于许多细胞类型，但根据应用和细胞类型的不同，通常使用不同的组分和浓度：

EDTA：粘附分子在钙离子存在时决定细胞-细胞和细胞-基质的互作，为了削弱互作联系，通常使用含EDTA的胰蛋白酶螯合二价阳离子。

酚红：pH指示剂。胰蛋白酶在pH 7-9范围内具有最佳活性，如果环境条件使胰蛋白酶pH变酸性(呈现橘色)，会导致酶活下降。使用NaOH调整pH至7.4-7.6，可优化胰蛋白酶活性。

稀释液：浓缩的胰蛋白酶通常使用缓冲液，如Hanks平衡盐溶液(货号：H9394)，进行溶解或稀释，从而维持pH和渗透压平衡。

来源和形式：胰蛋白酶的主要来源是猪，可以是冻干粉或溶液。为了避免动物或微生物物质，也可以在玉米中重组表达胰蛋白酶。

浓度：高浓度胰蛋白酶长期孵育会去除细胞表面蛋白，从而损伤细胞，甚至杀死细胞。根据不同的细胞类型和浓度，胰蛋白酶的使用浓度有很大差别。对于强贴壁细胞系，常使用0.25%-2.5%的胰蛋白酶。如果研究目的需要细胞表面蛋白的完整性，则应降低使用浓度(0.05%胰蛋白酶)。

好物推荐：

StableCell™胰酶溶液——无需冻存

节省时间：无需分装和反复冻融

存储方便：2-8°C储存，节省低温冰箱空间

性能稳定：即使储存在37°C也能保留90%以上的酶活和性能

应用广泛：已被证实可用于多种细胞类型

二、计数的重要性--细胞分析

监测和量化细胞健康和功能是获得有生物学意义数据的必要条件。为了快速高效的确定细胞状态，可以通过监测细胞大小以获得更多关于细胞健康和分化状态的信息，以及经常计数细胞以检查您的细胞培养物状况。

经典的细胞计数方法包括：
肉眼观察和明场成像：显微镜下通过肉眼观察和明场拍照观察细胞的覆盖度，一般当细胞到达80%左右覆盖度的时候，我们可以考虑消化收集细胞，进入下一个实验阶段。当然，不同的细胞对覆盖度的要求是不同的，一些容易结团的细胞，如B16，是不能生长到太高的覆盖度的。这种方法一般用于生长中的细胞的随时观察。肉眼观察的数据非常不稳定，成像的方法一致性更好。

血球计数板：血球计数板是经典的细胞计数方法。细胞消化收集后，将细胞点到血球计数板上，显微镜下观察计数四个象限的细胞个数，通过公式回算出细胞的浓度。血球计数板有玻璃的(可重复使用)；也有塑料材质的(一次性)、可用于基于成像法的细胞计数器，也可加入台盼兰染色区分细胞死活。这种方法靠人工计数速度慢，而靠成像仪器进行的计算也受到杂质和细胞碎片的干扰，结果的稳定性差。往往需要多次检测求取平均值，效率和准确性都很低。属于上一代的细胞计数方法。

库尔特计数法：库尔特计数法基于微流控芯片，类似流式一样形成单细胞悬液，对通过检测窗口的细胞加入电压，通过细胞电阻的大小来进行细胞个数和细胞直径的统计。库尔特方法计算得到的细胞数准确，稳定性好，多次检测的平均误差可以控制在10%以内。可同时满足快速高效进行细胞计数和细胞大小测定的双重需求。

库尔特原理是最精确的细胞计数方法， 基于库尔特原理的细胞计数器生成的数据，不仅提供精确的细胞计数, 还显示平均细胞大小和群体分布信息。使用库尔特细胞计数器的另一好处，是可以获得细胞群体大小分布的直方图，显示样品的单分散程度。

培养技巧：
1.确保计数的细胞是混合均匀的，否则会由于细胞密度的局部差异，导致计数有误。

2.转移细胞样品可能引入错误，在细胞培养罩内使用手持式自动细胞计数器，是避免可变性、获得培养物精确信息的最佳方式。

3.准备样品时，检测仪器规格，确保细胞直径和起始稀释度与计数方法兼容。

好物推荐：

小巧精准的手持式细胞计数器：ScepterTM 3.0

采用业界公认的“计数金标准”库尔特电阻抗原理，避免基于图像的传统细胞计数方法常见的失真现象。

不依赖用户的使用技巧或手动计算也可确保计数的准确性。

一次测量数以千计的细胞，精确度高。

独创的人体工程学设计，便于在超净台内进行测量和存放。

30秒内完成自动计数。

无需制备样品，不使用专用试剂，避免接触有害染料。

可通过监测细胞大小和形态，获得测量间，传代次数间和批次间的细胞健康状况。

无需清洁可持续操作。

三、血清的选择--细胞生长

胎牛血清(FBS)由于包含丰富的营养成分，被广泛作为细胞培养剂的补充物。细胞提供综合营养、激素、生长和附着因子，用于促进和维持脊椎动物、哺乳动物和昆虫细胞的生长。血清还可作为细胞培养系统的缓冲液，避免各种因素(包括pH变化、蛋白水解活性或重金属、内毒等)干扰细胞生长,或产生毒性作用。

血清质量是成功细胞培养的关键。然而，市面上FBS的来源地很多，质量良莠不齐，因此在选择和使用血清时,要格外注意。

培养技巧：
澳大利亚来源的FBS被公认为是品质更优、更安全的血清。

选择可靠的供应商，确保血清品质。

批量购买或挑选检测结果相近的批次，尽可能确保批间一致性。

选择血清时,注意查看指标和检测结果，包括过滤工艺、无菌处理、微生物检测、内毒素、血红蛋白等。

好物推荐：
澳大利亚特级胎牛血清和小牛血清

源自澳大利亚纯净之土，原产地溯源认证，通过正规渠道进口。

 血源采集、加工、过滤、包装、质检，物流遵循行业高标准。

可提供γ射线辐照处理的血清现货，灭活病毒和其他外来微生物。

经过细胞培养和杂交瘤细胞培养验证。