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主页PCR的应用REDExtract-N-Amp™组织PCR试剂盒实验方案

REDExtract-N-Amp™组织PCR试剂盒实验方案

货号XNATS, XNAT, XNATR

概览

REDExtract-N-Amp™组织PCR试剂盒包含从小鼠尾巴和其他动物组织、口腔拭子、毛干和唾液中快速提取和扩增基因组DNA所需的所有试剂。简而言之,在室温下将样品与提取溶液和组织制备溶液的混合物孵育10分钟,原料即可释放DNA。不需要机械破碎、有机提取、柱纯化或DNA沉淀。  

加入中和溶液B后,提取物可用于PCR。然后将等分的中和后的提取物与REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物和用户提供的PCR引物组合,即可扩增靶DNA。REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物是含有缓冲液、盐、dNTP和Taq聚合酶的2X反应混合物。其专门针对反应试剂进行了优化。它还含有JumpStart™ Taq抗体(用于热启动PCR以增强特异性),以及REDTaq® 染料(以将PCR产物直接加载到琼脂糖凝胶上)。

需要但未提供的试剂和仪器:

  • 微量离心管(1.5或2 mL)或多孔板用于提取(200 μL最小孔容积)
  • 剪刀,微型切割,货号Z265985
  • 镊子(中小款)
  • 口腔拭子(无菌泡沫尖涂抹器,货号A9601
  • 样品采集卡 — 血迹卡,货号C2613
  • 用于PCR的管或板
  • 95°C加热块或热循环仪
  • PCR引物
  • 热循环仪
  • 水,PCR试剂,货号W1754

操作流程

除非另有说明,否则所有步骤均在室温下进行。

A. 从小鼠尾巴、动物组织、毛发或唾液中提取DNA

  1. 移取100 μL提取溶液到微量离心管或多孔板的孔中。向管或孔中加入25 μL组织制备溶液,上下移液混合。

    注意:如果要进行多次提取,可以在使用前最多2小时以4:1的比例预先混合足量的提取和组织制备溶液。
     
  2. 对于新鲜或冷冻的小鼠尾巴:在使用前及处理不同样品的间隙,采用70%乙醇冲洗剪刀和镊子。将0.5-1 cm的小鼠尾尖(切割端向下)放入溶液中。通过涡旋或移液彻底混合。确保小鼠尾巴浸没在溶液中。

    注意:对于新鲜小鼠尾巴,请在剪断尾巴后30分钟内进行提取。

    对于动物组织:在使用之前及处理不同样品的间隙,采用70%乙醇冲洗剪刀或手术刀和镊子。将2-10 mg组织块放入溶液中。通过涡旋或移液彻底混合。确保组织浸没在溶液中。

    对于发干在使用前及处理不同样品的间隙,采用70%乙醇冲洗剪刀和镊子。剪去多余的发干,保留发根,将样品(根端向下)放入溶液中。每次提取只需要一根带根的发干。

    对于唾液:移取10 μL唾液到溶液中。通过涡旋或移液彻底混合。

    对于在卡片上干燥的唾液:将50 μL唾液吸移到收集卡上,并使卡片干燥。使用前和不同样品之间用70%乙醇冲洗打孔器。在卡上有干燥唾液样品的区域用打孔机冲下一片圆片(最好是1/8英寸或3 mm)。将圆片放入溶液中。在硬表面上轻敲管或板,以确保圆片在培养期间浸于溶液中。
     
  3. 在室温下孵育样品10分钟。 
  4. 将样品在95°C孵育3分钟。
    注意:孵育结束时组织不会被完全消化。这是正常现象,不会影响性能。
     
  5. 向样品中加入100 μL中和溶液B,并涡旋混合。 
  6. 将中和的组织提取物储存在4°C或立即用于PCR。继续第C部分第1步。
    注意:长期储存时,取出未消化的组织,或将提取物转移到新的试管或孔中。提取物现在可以在4°C下储存至少6个月,在大多数情况下没有明显的损失。

注意:第C部分第1步 — 长期储存时,取出未消化的组织,或将提取物转移到新的试管或孔中。提取物现在可以在4°C下储存至少6个月,在大多数情况下没有明显的损失。

B. 口腔拭子的DNA提取

  1. 收集拭子上口腔细胞,让拭子干燥。干燥时间约为10至15分钟。
    注意:由于用于DNA提取的溶液体积较小,应使用泡沫尖端拭子。应避免使用纤维尖端的拭子,如棉花或涤纶拭子,因为溶液无法有效回收。 
  2. 移取200 μL提取溶液到1.5 mL微量离心管中。向管加入25 μL组织制备溶液,上下移液混合。
    注意:如果要进行多次提取,可以在使用前最多2小时以8:1的比例预先混合足量的提取和组织制备溶液。 
  3. 将干燥的口腔拭子放入溶液中并在室温下孵育1分钟。 
  4. 在溶液中转动拭子10次,然后将拭子转动着在管壁上抿,以从拭子中将多余的溶液挤出。丢弃拭子。盖上管盖并短暂离心。 
  5. 在室温下孵育样品10分钟。 
  6. 将样品在95°C孵育3分钟。 
  7. 向样品中加入200 μL中和溶液B,并涡旋混合。 
  8. 将中和的提取物储存在4°C或立即用于PCR。继续第C部分第1步。
    注意:提取物可在4 °C下储存至少6个月,在大多数情况下没有明显的损失。

C. PCR扩增

REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物含有JumpStart Taq抗体,用于特定的热启动扩增。因此,PCR反应可以在室温下进行而不会过早产生Taq DNA聚合酶活性。

典型的最终引物浓度约为0.4 μM。最佳引物浓度和循环参数取决于所使用的系统。

     1.将以下试剂加入到薄壁PCR微量离心管或板中:

注意:REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物配方用于补充提取、组织制备和中和溶液中的成分。如果将少于4 μL的组织提取物添加到PCR反应物中,则按50:50的提取物:中和溶液B混合比例,使组织提取物的体积达到4 μL。

     2.轻轻混合。
     3.对于没有加热盖的热循环仪,在每个管的混合物顶部添加20 μL矿物油以防止蒸发。                        进行热循环。扩增参数应
4. 针对各个引物、模板和热循环仪进行优化。

5.PCR结束后,将扩增的DNA加到琼脂糖凝胶上。不必加入单独的 上样缓冲液/示踪染料。
注意:如果需要,可以对PCR产物进行纯化,用于下游应用,例如使用GenEluteTM PCR清除试剂盒(货号NA1020)进行测序。

故障排除

产品列表
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参考文献

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致购买者:有限许可证

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JumpStart和JumpStart抗体在美国获得许可。专利号5,338,671和5,587,287以及在其他国家的相应专利。

GenElute、JumpStart和REDExtract-N-Amp是Sigma-Aldrich Co. LLC.的商标。
REDTaq是Sigma-Aldrich Co. LLC.的注册商标。

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