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锁核酸

LNA是一种新型核酸类似物，含有2'-O，4'-C亚甲基桥（图1）。这种桥接锁定在3'-内构象中，限制了呋喃核糖环的灵活性，并将结构锁定为刚性双环形式。这意味着更强的分析性能和更广泛的应用。 

LNA和天然状态DNA单体

图 1.LNA和天然状态DNA单体的结构。

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PCR引物、qPCR探针和其他类型寡核苷酸中的锁核酸可溶于水和标准缓冲液，并遵循Watson-Crick碱基配对规则。1

优点

当LNA被掺入qPCR探针时，与天然状态DNA碱基相比，它具有多种优势，包括：

  • 热稳定性和杂交特异性更高
  • 基因定量和等位基因鉴别更准确
  • 针对有问题的靶序列，探针设计更容易、更灵活

热稳定性和杂交特异性更高

将LNA掺入qPCR探针可提高双链体热稳定性2，并提高探针与靶序列杂交的特异性。3 这减少了来自伪结合的背景荧光，从而提高了信噪比。此外，与天然状态DNA qPCR探针相比，LNA探针与其靶标的杂交得到改善，在培养基盐条件下，每取代一个LNA单体，解链温度 (Tm)提高多达8℃4（表1）。杂交的这种增加大大拓宽了测定条件范围，实现更成功的多重测定。5

表1增加qPCR探针中LNA碱基的数量会提高Tm。

*探针与其互补序列之间的双链Tm。
粗体序列表示LNA碱基。

基因定量和等位基因鉴别更准确

掺入LNA碱基后，qPCR探针通过SNP区分等位基因的能力大大增强6-8（图2）。与天然状态DNA qPCR探针相比，单碱基错配的存在对LNA qPCR探针与其靶标之间的双链体形成具有更大的去稳定作用。掺入LNA碱基的较短qPCR探针可以在与较长天然状态DNA qPCR探针相同的温度下使用。

LNA双标记探针在SNP基因分型分析中比DNA双标记探针具有更好区分能力。

图 2.LNA双标记探针在SNP基因分型分析中比DNA双标记探针具有更好区分能力9。粉色）用LNA突变探针（具有3个LNA碱基的16聚体）进行突变DNA分析。绿色）用天然状态DNA突变探针（25聚体）进行突变DNA分析。红色）具有天然状态DNA突变探针（25聚体）的野生型DNA。紫色）具有LNA突变探针（具有3个LNA碱基的16聚体）的野生型DNA。

针对有问题的靶序列，探针设计更容易、更灵活

由于LNA的杂交特征改善，并伴随着Tm增加，LNA qPCR探针可以被合成得更短，这克服了天然状态DNA qPCR探针存在的某些设计限制。具体而言，可以设计LNA qPCR探针来解决传统上有问题的靶序列，例如富含AT或GC的区域。例如，富含AT的天然状态DNA qPCR探针通常需要超过30个碱基（有时超过40个碱基）以满足扩增子设计指南，但仍可能表现不佳。使用LNA qPCR探针，LNA碱基的选择性放置有助于优化设计高度特异性、较短的qPCR探针，即使仅有13至20个碱基，也能表现良好。此外，LNA极大地促进了用于靶向困难SNP的qPCR探针的设计，例如相对稳定的G:T错配。 

其他优点

LNA qPCR探针与所有实时热循环仪和终点分析检测仪器​​兼容。不需要专门的工具。

应用

LNA可以掺入所有可用的qPCR检测化学品，包括：

  • SYBR® Green 引物
  • 双标记探针
  • Molecular Beacons
  • LightCycler® 探针
  • Scorpions® 探针

并且，可用于以下应用：

  • SNP检测
  • 等位基因鉴别
  • 病原体检测
  • 多重测定（Multiplexing）
  • 病毒含量定量
  • 基因表达分析
  • 基因拷贝测定

其还可用于以下序列：

  • 反义寡核苷酸
  • 脱氧寡核苷酸
  • 捕获探针
  • 核酸适配体
  • 核酶
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参考文献

1.
Egli M, Teplova M, Minasov G, Kumar R, Wengel J. 2001. X-ray crystal structure of a locked nucleic acid (LNA) duplex composed of a palindromic 10-mer DNA strand containing one LNA thymine monomer. Chem. Commun..(7):651-652. https://doi.org/10.1039/b009447l
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