细胞活力和增殖检测

DNA合成增殖检测
代谢增殖检测
发光细胞活力检测
荧光染料增殖检测
3D细胞培养- 活/死/总细胞三重染色
台盼蓝细胞计数

介绍

可测量细胞增殖、细胞活力和细胞毒性的检测常被用于监测用各种刺激物处理后培养物中细胞的应答和健康状况。检测方法的正确选择取决于所用的细胞数、类型以及预期的结果。细胞增殖的检测可以监测一段时间内的细胞数、细胞分裂的次数、代谢活性或DNA合成。使用诸如台盼蓝或钙黄绿素-AM等活性染料进行的细胞计数可以提供增殖率以及存活细胞的百分比。

细胞活力和增殖检测概览

DNA合成增殖检测

BrdU细胞增殖检测

细胞增殖可通过监测放射性同位素[3H]-胸苷向细胞DNA中的掺入并进行放射自显影而进行研究。或者，也可以使用5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU检测）来代替胸苷。DNA中掺入了BrdU的细胞可通过使用针对BrdU的单克隆抗体以及偶联了酶或荧光的二抗而被轻松检测到。

图1.A，利用BrdU染色观察E4鸡胚眼中的增殖细胞 B，使用喜树碱进行的抗-BrdU抗体验证.通过用细胞周期停滞剂喜树碱处理Jurkat细胞，循环细胞在G1/S相变期间被捕捉到。

EdU增殖检测

Baseclick EdU增殖检测为复制中DNA的荧光检测提供了一种有效的方法。修饰后的核苷EdU被添加到活细胞中并掺入至复制中的DNA中。引入Cu的点击化学可实现将荧光探针与EdU快速结合。这为正在增殖的细胞提供了一种定量的监测方法。这些检测可提供多种形式，用于显微镜成像、流式细胞分析、高通量筛选以及体内实验。可提供激发峰在488、555、594和647的四种不同荧光探针用于与其他荧光探针的多重检测能力。

图2.Edu-Click细胞增殖试剂盒可将EdU（5-乙炔基-2′-脱氧尿苷）掺入至正在进行DNA合成的DNA中，并通过点击化学荧光检测方法进行测量。

代谢增殖检测

可测量代谢活性的检测可适用于增殖、活力和细胞毒性的分析。仅在代谢活跃的细胞中发生将四唑盐如MTT, XTT, 和 WST-1还原为有色的甲臜化合物或刃天青的生物还原。主动增殖细胞会提高它们的代谢活性，而暴露于毒素的细胞活性会降低。

MTT细胞增殖检测

MTT（3- [4,5-二甲基噻唑-2-基] -2,5-二苯基溴化四唑;噻唑蓝）是一种水溶性四唑盐，在缺少酚红的培养基或盐溶液中制备时会生成淡黄色的溶液。溶解的MTT会因为脱氢酶对四唑环的切割而被转化为不溶的紫色甲臜。该水不溶性的甲臜可使用异丙醇或其他溶剂进行溶解，并使用吸光度作为转化染料浓度的函数而通过分光光度法对溶解的物质进行测量。

XTT细胞增殖检测

与XTT相反，XTT的切割产物是溶于水的；因此不需要溶解步骤。四唑盐XTT会通过一个复杂的细胞机制而被切割成甲臜。该生物还原仅发生在活细胞内，并与通过糖酵解的NAD(P)H生成相关。所形成的甲臜染料量与培养物中代谢活跃细胞的数量直接相关。

WST-1细胞增殖检测

稳定的四唑盐WST-1会通过一种主要发生在细胞表面的复杂细胞机制而被切割成一种可溶性的甲臜。该生物还原主要依赖于发生在活细胞内的糖酵解NAD(P)H生成。所形成的甲臜染料量与培养物中代谢活跃细胞的数量直接相关。

实验方法指南：用于细胞活力和增殖的WST-1检测。实验方法、FAQ和疑难排查

图3.MTT检测是一种基于代谢活性评估细胞增殖的比色检测。NAD(P)H依赖型的细胞氧化还原酶可反映出存在的活细胞数量。存在有三种酶可将黄色的四唑染料MTT 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑还原成其紫色的不溶性甲臜。

发光细胞活力检测

由于ATP是代谢活跃细胞的一种指示剂，因此可根据可用的ATP量来评估活细胞的数量。ATP细胞活力萤光素酶检测可提供一种高度灵敏的均相检测用于定量细胞培养物中的ATP。该试剂盒利用萤火虫萤光素酶氧化D-萤光素，并通过所生成的光来评估细胞培养物中可用的ATP量。这种灵敏的检测方法仅需要将ATP检测混合物直接添加到在含血清培养基中培养的细胞中。无需细胞洗涤、培养基去除或多步移液。该试剂盒足够灵敏到用于检测单细胞细胞或0.01皮摩尔的ATP。所产生的信号具有六个数量级的线性度。通过将ATP的量与活细胞的数量相关联，该检测具有广泛的应用范围，包括从确定活细胞的数量到细胞增殖再到细胞毒性。

图4.生物发光ATP荧光素酶细胞活力检测。萤火虫萤光素酶利用ATP氧化D-萤光素以及所生成的光用于评估与细胞数量和活力相关的可用ATP量。

荧光染料增殖检测

CFSE标记

5(6)-羧基荧光素二乙酸酯N-琥珀酰亚胺酯（CFSE）是测量细胞群分裂代数的普遍选择。进入细胞后，CFSE会被细胞内酯酶裂解形成荧光化合物，而琥珀酰亚胺基酯基会与细胞内蛋白上的伯胺发生共价反应。分裂后，每个子细胞的荧光强度会减半，使得可以通过流式细胞仪而对细胞分裂的代数进行简单的检测。CFSE已被广泛用于包括T细胞在内的淋巴细胞增殖。

活/死细胞双重染色

活/死细胞双重染色可被用于活细胞和死细胞的同时荧光检测。钙黄绿素-AM是一种高度亲脂且具有细胞膜通透性的染料。尽管钙黄绿素-AM本身并不是荧光分子，但钙黄绿素-AM在活细胞中的酯酶作用下所产生的钙黄绿素可发出强烈的绿色荧光（λex490 nm，λem515 nm）。因此钙黄绿素-AM仅能将活细胞进行染色。相比之下，核染料碘化丙啶则不能通过活细胞膜。它会穿过死细胞膜的无序区域到达细胞核，并插入DNA双螺旋以发出红色荧光（λex535 nm，λem617 nm）。由于钙黄绿素和PI-DNA均可被490 nm的光激发，因此可通过单激发荧光显微镜同时监测活细胞和死细胞。

图5.活/死细胞双重染色

3D细胞培养- 活/死/总细胞三重染色

细胞活力成像试剂盒是一种三色检测，可与2D和3D细胞培养物一起使用用于对活细胞（钙黄绿素-AM）、死细胞（碘化丙啶/ PI）以及总细胞（Hoechst 33342）同时进行荧光染色。

钙黄绿素-AM会在结合钙上发出绿色荧光，依赖于仅在具有代谢活性的活细胞中存在的酯酶活性。
碘化丙啶（PI）是一种会被活细胞的膜排除在外的核染料，但它会穿过受损的死细胞膜并插入DNA以发出强烈的红色荧光。
Hoechst 33342是一种具有低细胞毒性的DNA染料。它会发出蓝色荧光并用于总细胞计数的指示剂。

台盼蓝细胞计数

台盼蓝是推荐用于通过染料排除法进行细胞计数的几种染料之一。此方法基于的原理是活细胞不吸收蓝色染料而死细胞（非活细胞）会吸收蓝色染料。细胞活力可通过使用总活细胞/总细胞（活细胞和死细胞）之比而进行计算。染色还有利于整体细胞形态的可视化。

注意：台盼蓝对血清蛋白的亲和力要大于对细胞蛋白的亲和力。如果由于基质中存在血清而导致背景太暗，则应在沉淀前将细胞进行沉淀并重悬于无蛋白的培养基或盐溶液中。

图6.使用血细胞计数器和台盼蓝进行细胞计数

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参考文献

Slater T, Sawyer B, Sträuli U. 1963. Studies on succinate-tetrazolium reductase systems. Biochimica et Biophysica Acta. 77383-393. https://doi.org/10.1016/0006-3002(63)90513-4

Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65(1-2):55-63. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4

Denizot F, Lang R. 1986. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Journal of Immunological Methods. 89(2):271-277. https://doi.org/10.1016/0022-1759(86)90368-6

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