描述
该程序描述了透明质酸酶活性的比浊测定法（600 nm 处的透光率 %，光程 =1 cm）。它基于以下反应：
透明质酸酶
透明质酸------------------>二糖和单糖 + 较小的透明质酸片段
单位定义：一个单位活性的透明质酸酶在 pH 5.35、37°C下、2.0 ml 反应混合物中（45 分钟测定）中将引起每分钟 0.330 的A600变化。
所需试剂和设备
5.0 M 磷酸二氢钠溶液（货号74092）
0.5 M 磷酸氢二钠溶液（货号94046）
5.0 M氯化钠溶液（货号S6546）
牛血清白蛋白（货号A4503）
醋酸钠（货号S8625）
乙酸（货号695092）
比色皿
注意事项——有关危害和安全操作规范的信息，请参阅安全数据表。
制备说明
使用超纯水（25 °C时 ≥ 18 MΩ×cm电阻率）制备试剂。
磷酸盐缓冲液（300 mM 磷酸钠，pH 5.35，37°C）——使用 5.0 M 磷酸二氢钠溶液（货号74092）在超纯水中配制 1:16.7 稀释液。用 1m NaOH 或 1m HCl 在 37℃ 调节 pH 至 5.35。
透明质酸溶液 [0.03% (w/v)]
- 使用透明质酸（货号H7630或H5388）配制溶于磷酸盐缓冲液的 0.3 mg/ml 溶液。
- 搅拌下将溶液加热至 90-95°C，直至透明质酸溶解。这种材料需要 15 到 30 分钟的加热和搅拌才能完全溶解。不要煮沸。
- 溶解后，让溶液在水浴中冷却至 37℃。使用超纯水调节溶液至原始体积。用 1m NaOH 或 1m HCl 在 37℃ 调节 pH 至 5.35。
酶稀释剂 [20 mM 磷酸钠与 77 mM 氯化钠和 0.01% (w/v) 牛血清白蛋白，pH 7.0，37°C] - 制备 200 mL：
- 加入 8.46 mL 0.2 M 磷酸二氢钠（使用货号74092的产品用超纯水制备）。
- 在超纯水中加入 11.54 mL 0.2 M 磷酸氢二钠（使用货号94046的产品制备）。
- 加入3.08 mL的5.0 M 氯化钠溶液（货号S6546）。
- 加入 20 mg 牛血清白蛋白（货号A4503）。
- 加入超纯水补足至最终体积。
- 用 1 MNaOH 或 1 MHCl 在 37°C 调节 pH 至 7.0。
酸性白蛋白溶液 [24 mM 乙酸钠，79 mM 乙酸，含 0.1% (w/v) 牛血清白蛋白，25°C，pH 3.75] – 制备 150 mL：
- 加入 3.6 mL 1.0 M 乙酸钠原液，pH 4.8（使用货号S8625产品制备）。
- 加入 0.68 mL 乙酸（货号695092）。
- 加入 150 mg 牛血清白蛋白（货号A4503）。
- 加入超纯水补足至最终体积。
- 用 5 MHCl 在 25°C 调节 pH 至 3.75。
酶液（透明质酸酶）——临用前，用冷酶稀释液配制 1000 单位/mL 酶原液。用冷酶稀释液稀释酶原液，得到 ~6 单位/mL 的工作液。
操作流程
最终测定浓度——在 2.0 mL 反应混合物中，最终浓度为 0.015% (w/v) 透明质酸、150 mM 磷酸钠和 2-5 单位透明质酸酶。
注意：将所有试样和空白错开至少 30 秒，以便在室温孵育之前有足够的时间倒置混合每份试样和空白。
1.将下列试剂移至合适的容器中：
2.涡旋混合并平衡至 37°C，保持 10 分钟。然后添加：
3.立即涡旋混匀，37°C 培养 45 分钟整。
4.45 分钟后，各试样和空白取 0.5ml 转移到含有 2.5ml 酸性白蛋白溶液的合适比色皿中
并立即倒置混匀。
5.让每个比色皿在室温下静置 10 分钟。
注意：如果孵育时间不是 10 min，结果会发生显著变化。
6.测定 600 nm 处的 % 透射率。
- 将分光光度计与空白对齐。读取试样和空白的 % 透射率。
注意：将样品一起分批时，将分光光度计与准备好的相应空白溶液进行空白测试。 - 每次测试的未校正 % 透射率必须在130–170%之间。每次测试至少需要三个有效值才能计算活性。
注意：可调节酶溶液的浓度，使结果在有效透过率 % 范围内。
结果
计算
1.
(%T 试样 – %T 空白) (df)
单位/mL 酶 = -----------------------------------------------
(14.84) (ml 酶溶液)
其中
df = 酶的稀释因子
14.84=Sigma-Aldrich 测定的消光系数
ml 酶溶液 = 反应所用酶溶液的体积
2.
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