Black Hole Quencher™
TAMRA™和DABYCL这两种常用淬灭剂限制了qPCR的最终灵敏度和灵活性。TAMRA不是暗淬灭剂，因此由于其自身的天然荧光而造成背景总体增加。DABCYL虽然是一种暗淬灭剂，但其吸收足迹不足，与480 nm以上发射的报告染料重叠很差（图2）。
图 2.DABCYL-T9的吸收光谱与常用报告染料6-FAM™、TET™和JOE™的发射光谱。DABCYL在聚-T吸光度（260 nm）处标准化。RFU = 相对荧光单位。
虽然DABYCL在Molecular Beacons（结构化探针，含有配对报告染料和基于静态淬灭的淬灭剂）中很有效，但其474 nm的最大吸收低于图2所示报告染料的最大值，因此对于双标记探针（含有单独报告染料和基于FRET淬灭的淬灭剂的线性探针）来说它不是一个好的选择。
黑洞淬灭剂1 (BHQ™-1)（具有534 nm吸收最大值）在比DABCYL更高的波长下被吸收，可直接与FAM、TET和JOE的发射最大值重叠。这使静态和FRET淬灭效率显著增加，从而使其成为Molecular Beacons和双标记探针的优异淬灭剂。如图3所示，BHQ™-1、BHQ™-2和BHQ™-3覆盖从480 nm到近红外的光谱，因此可以使用在该范围内任何地方发射的报告染料。
图 3.三种BHQ™型号（与T-9缀合，并按260 nm的聚-T吸光度标准化）的吸收光谱，以及常用报告染料6-FAM、TET、HEX™、青色素3、TAMRA、ROX™、LC红640和青色素5的最大发射波长。
与相应的DABCYL或TAMRA探针相比，除了具有较好的光谱重叠外，BHQ™探针还具有高得多的信噪比（图4）。
图 4.在存在5倍过量的精确互补的靶序列的情况下，将25聚体的荧光信号除以探针单独的荧光强度，所得结果即为信噪比(S:N)。
最后，如图5所示，BHQ™变体允许单管多重测定，因为报告染料种类增加，所以可以有效地淬灭，却很少存在或完全不存在串扰。这简化了多重测定的设计、实施和解读。
图 5.各种BHQ™的独特性允许灵活选择光谱良好分辨的报告染料，这在单管多重测定中很少或没有串扰。
总之，Black Hole Quencher™：
- 没有天然荧光（发热而不是发光），因此背景荧光较低
- 增加了信噪比，具有更高的灵敏度
- 使更多的报告染料能够用于多重测定
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