跳转至内容
Merck
CN
主页酶活性测定透明质酸酶的酶法测定 (3.2.1.35)

透明质酸酶的酶法测定 (3.2.1.35)

描述

该程序描述了透明质酸酶活性的比浊测定法(600 nm 处的透光率 %,光程 =1 cm)。它基于以下反应:

                        透明质酸酶

透明质酸------------------>二糖和单糖 + 较小的透明质酸片段

单位定义:一个单位活性的透明质酸酶在 pH 5.35、37°C下、2.0 ml 反应混合物中(45 分钟测定)中将引起每分钟 0.330 的A600变化。

所需试剂和设备

5.0 M 磷酸二氢钠溶液(货号74092

透明质酸(货号 H7630H5388

0.5 M 磷酸氢二钠溶液(货号94046

5.0 M氯化钠溶液(货号S6546

牛血清白蛋白(货号A4503

醋酸钠(货号S8625

乙酸(货号695092

比色皿

注意事项——有关危害和安全操作规范的信息,请参阅安全数据表。

制备说明

使用超纯水(25 °C时 ≥ 18 MΩ×cm电阻率)制备试剂。

磷酸盐缓冲液(300 mM 磷酸钠,pH 5.35,37°C)——使用 5.0 M 磷酸二氢钠溶液(货号74092)在超纯水中配制 1:16.7 稀释液。用 1m NaOH 或 1m HCl 在 37℃ 调节 pH 至 5.35。

透明质酸溶液 [0.03% (w/v)]

  1. 使用透明质酸(货号H7630H5388)配制溶于磷酸盐缓冲液的 0.3 mg/ml 溶液。
  2. 搅拌下将溶液加热至 90-95°C,直至透明质酸溶解。这种材料需要 15 到 30 分钟的加热和搅拌才能完全溶解。不要煮沸。
  3. 溶解后,让溶液在水浴中冷却至 37℃。使用超纯水调节溶液至原始体积。用 1m NaOH 或 1m HCl 在 37℃ 调节 pH 至 5.35。

酶稀释剂 [20 mM 磷酸钠与 77 mM 氯化钠和 0.01% (w/v) 牛血清白蛋白,pH 7.0,37°C] - 制备 200 mL:

  1. 加入 8.46 mL 0.2 M 磷酸二氢钠(使用货号74092的产品用超纯水制备)。
  2. 在超纯水中加入 11.54 mL 0.2 M 磷酸氢二钠(使用货号94046的产品制备)。
  3. 加入3.08 mL的5.0 M 氯化钠溶液(货号S6546)。
  4. 加入 20 mg 牛血清白蛋白(货号A4503)。
  5. 加入超纯水补足至最终体积。
  6. 用 1 MNaOH 或 1 MHCl 在 37°C 调节 pH 至 7.0。

酸性白蛋白溶液 [24 mM 乙酸钠,79 mM 乙酸,含 0.1% (w/v) 牛血清白蛋白,25°C,pH 3.75] – 制备 150 mL:

  1. 加入 3.6 mL 1.0 M 乙酸钠原液,pH 4.8(使用货号S8625产品制备)。
  2. 加入 0.68 mL 乙酸(货号695092)。
  3. 加入 150 mg 牛血清白蛋白(货号A4503)。
  4. 加入超纯水补足至最终体积。
  5. 用 5 MHCl 在 25°C 调节 pH 至 3.75。

酶液(透明质酸酶)——临用前,用冷酶稀释液配制 1000 单位/mL 酶原液。用冷酶稀释液稀释酶原液,得到 ~6 单位/mL 的工作液。

操作流程

最终测定浓度——在 2.0 mL 反应混合物中,最终浓度为 0.015% (w/v) 透明质酸、150 mM 磷酸钠和 2-5 单位透明质酸酶。
注意:将所有试样和空白错开至少 30 秒,以便在室温孵育之前有足够的时间倒置混合每份试样和空白。

1.将下列试剂移至合适的容器中:

2.涡旋混合并平衡至 37°C,保持 10 分钟。然后添加:

3.立即涡旋混匀,37°C 培养 45 分钟。  

4.45 分钟后,各试样和空白取 0.5ml 转移到含有 2.5ml 酸性白蛋白溶液的合适比色皿中
    并立即倒置混匀。  

5.让每个比色皿在室温下静置 10 分钟。
   注意:如果孵育时间不是 10 min,结果会发生显著变化。

6.测定 600 nm 处的 % 透射率。

  • 将分光光度计与空白对齐。读取试样和空白的 % 透射率。
    注意:将样品一起分批时,将分光光度计与准备好的相应空白溶液进行空白测试。  
  • 每次测试的未校正 % 透射率必须130–170%之间。每次测试至少需要个有效值才能计算活性。
    注意:可调节酶溶液的浓度,使结果在有效透过率 % 范围内。

结果

计算

1.

                                              (%T 试样 – %T 空白) (df)
单位/mL 酶 =  -----------------------------------------------
                                                (14.84) (ml 酶溶液)

其中
df = 酶的稀释因子
14.84=Sigma-Aldrich 测定的消光系数
ml 酶溶液 = 反应所用酶溶液的体积

2.

透明质酸酶-eq1
材料
Loading
登录以继续。

如要继续阅读,请登录或创建帐户。

暂无帐户?