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Merck
CN

低水平细胞因子多重分析：384孔与96孔高灵敏度T细胞Panel的比较

低水平的慢性炎症反应会诱发致命疾病。高灵敏度多重检测panel让研究人员得以检测低水平细胞因子和一次性检测多种细胞因子，深入了解这些低水平炎症过程。本文比较了MILLIPLEX® Human High Sensitivity T Cell Panel（人类高灵敏度T细胞多重检测试剂盒）384孔和96孔规格的性能。

细胞因子与炎症有何联系？

细胞因子是细胞信号传导中重要的免疫调节多肽，在天然和适应性免疫中均起关键作用。根据其来源或功能可分为白介素（T细胞相互作用介质）、趋化因子（负责T细胞迁移）、淋巴因子（活化辅助性T细胞(Th)产生）和肌肉因子（肌肉细胞产生）。细胞因子用于免疫应答的识别、活化和/或效应期，以调节T细胞、B细胞和髓系细胞的发育和功能性活动。

在正常和疾病状态中，细胞因子是炎症、免疫细胞发育和免疫细胞激活的重要介质。大量证据表明，较低水平的慢性炎症也参与多种临床和亚临床疾病过程。美国疾控中心表示，在美国，低水平慢性炎症是引发致命疾病的首要原因，如心血管疾病、中风、阿尔茨海默病、糖尿病和癌症1。

因此，细胞因子相关研究有助于更深入了解免疫系统及其复杂的相互作用，这些作用会引起炎症反应，直接导致致命疾病。对这些细胞因子的低水平和同步多重检测能力是深入研究的一大助力。

High Sensitivity T Cell MILLIPLEX® Multiplex Panels

基于Luminex® xMAP®液相悬浮芯片技术，针对相同分析物的MILLIPLEX®检测试剂盒分为两种规格：384孔和96孔。384孔版MILLIPLEX® Human High Sensitivity T Cell Panel的（货号HSTC384-28K）和96孔版MILLIPLEX® Human High Sensitivity T Cell Panel（货号HSTCMAG-28SK）均为21重多指标检测试剂盒，可同步检测Th1、Th2和Th17细胞相关重要细胞因子。这两种panel均为可定制试剂盒，用户可选择任意数目的panel分析物指标，满足自身研究需求。两种panel也都提供预混微球形式的21重试剂盒。96孔版还提供限定分析物种类的13重预混试剂盒。

比较384孔和96孔试剂盒的分析方案

384孔和96孔试剂盒分析方案的对比如表1所示。两者的整体实验流程略有不同，主要是384孔版有些调整（比如，需要FLEXMAP 3D®或xMAP® INTELLIFLEX仪器，还有洗板机，推荐BioTek® MultiFlo™ FX自动洗板机）。384孔洗板机可确保最佳结果。更多细节参见试剂盒说明书(protocol)。

对于血清样品，血液凝固30分钟后以1000 x g离心10分钟。提取的血清可立即检测，或-20 °C储存。对于添加EDTA抗凝剂的血浆样品，采集血液后30分钟内1000 x g离心。提取的血浆可立即检测，或-20 °C储存。冻存样品在使用前完全解冻、涡旋振荡并离心，以去除颗粒物。样品不做稀释，直接加入微孔板。样品来自BioIVT公司(Westbury, NY)。

384孔试剂盒96孔试剂盒
80 μL洗涤缓冲液预润湿。振荡10分钟。干燥。200 μL洗涤缓冲液预润湿。振荡10分钟。干燥。
血清基质重悬至4 mL。血清基质重悬至4 mL。
用血清基质重悬和稀释标准品和质控品。用血清基质重悬和稀释标准品和质控品。

将标准品和样品加入孔中。

  • 标准品孔：加入40 µL标准品/质控品或基质（背景孔），和10 µL微球。
  • 样品孔：加入20 µL检测缓冲液，20 µL样品和10 µL微球。

将标准品和样品加入孔中。

  • 标准品孔：加入50 µL标准品/质控品或基质（背景孔），和25 µL微球。
  • 样品孔：加入25 µL检测缓冲液，25 µL样品和25 µL微球。
微孔板200 x g离心1分钟，然后在振荡器上4 °C孵育过夜（16-18小时）。在振荡器上4 °C孵育过夜（16-18小时）。
用80 μL洗涤缓冲液洗涤3次。注：建议使用洗板机。用200 μL洗涤缓冲液洗涤3次。注：使用洗板机或手持式清洗器
加入20 μL检测抗体混合物。200 x g离心1分钟。加入50 μL检测抗体混合物。
在振荡器上室温孵育1小时。在振荡器上室温孵育1小时。
加入20 μL SAPE。200 x g离心1分钟。加入50 μL SAPE。
在振荡器上室温孵育30分钟。

 

在振荡器上室温孵育30分钟。

 

用80 μL洗涤缓冲液洗涤3次。注：建议使用洗板机。用200 μL洗涤缓冲液洗涤3次。注：使用洗板机或手持式清洗器
加入70 μL Sheath Fluid PLUS（加强型鞘液），振荡5 min。在Luminex® FLEXMAP 3D®或xMAP® INTELLIFLEX仪器上读数（50 μL，每组微球50 beads）。加入150 µL Sheath Fluid PLUS或Drive Fluid PLUS，振荡5分钟。在Luminex®仪器上读数（100 μL，每组微球50 beads）。
表1.MILLIPLEX®检测方案比较（384孔 PK 96孔）
QC = 质量控制；RT = 室温；SAPE = 链霉亲和素-藻红蛋白

多重定量分析结果

在开发、验证和质量控制过程中，所有试剂盒均执行了严格的性能检查，包括明确标准曲线范围、交叉反应性、回收率、精密度和灵敏度。下列数据表明，384孔试剂盒的性能与广泛使用的96孔试剂盒相当，有时甚至更为优异。

标准曲线

384孔和96孔MILLIPLEX® Human High Sensitivity T Cell Panel的标准曲线分别如图1a和图1b所示。两种规格都具有较宽的线性范围，对每种分析物的标准曲线范围(pg/mL)相同。

384孔试剂盒标准曲线

图1a 384孔试剂盒标准曲线。

图示96孔MILLIPLEX® Human High Sensitivity T Cell Panel的标准曲线。

图1b 96孔试剂盒标准曲线。

为了更仔细地观察比对每种分析物的标准曲线，图2将一些分析物的384孔和96孔数据绘制在同一张图中。

图示384孔和96孔MILLIPLEX® Human High Sensitivity T Cell Panel对各个分析物(GM-CSF, IL-12 (p70), IL-8, TNFα)的标准曲线。

图 2.选定分析物各自的标准曲线对比（384孔和96孔）。

交叉反应性

通过一次标准的交叉反应试验测定检测中潜在的分析物交叉反应性。在多重微球和检测抗体的存在下，分别测试每种标准品。所有标准品与其他assay的交叉反应性低于5%。384孔与96孔试剂盒的交叉反应性数据相当（数据未显示）。

检测准确度和回收率

检测准确度定为已知量的标准品加入血清基质后所测浓度（与理论值）的比值。所有检测试剂盒的加标回收率均在79%和108%之间。384孔与96孔试剂盒的检测准确度数据相当，详见表2。

分析物%回收率，血清基质
384孔过夜方案96孔过夜方案
ITAC94106
GM-CSF94101
Fractalkine108101
IFNγ95101
IL-1093104
MIP-3α93101
IL-12 (p70)101100
IL-1389103
IL-17A94106
IL-1β9498
IL-291103
IL-2194101
IL-490103
IL-2390100
IL-588101
IL-679107
IL-78398
IL-891103
MIP-1α95101
MIP-1β9698
TNFα91103
表2.血清基质中低、中和高浓度加标的平均回收率。384孔检测 n=3，96孔检测 n=4。

精密度

所有分析物的分析内(Intra-assay)精密度(%CV)小于或等于10%，测定数据来自8个重复的质控品(standard control)。所有分析物的分析间(Inter-assay)精密度(%CV)小于或等于25%，测定数据来自11次独立实验，每次设重复性质控品。384孔与96孔试剂盒的分析间和分析内的精密度数据相当（表3）。

分析物384孔过夜方案96孔过夜方案
分析内%CV分析间%CV分析内%CV分析间%CV
ITAC<10%<20%<5%<15%
GM-CSF<5%<25%<5%<15%
Fractalkine<10%<25%<5%<15%
IFNγ<5%<20%<5%<20%
IL-10<10%<25%<5%<20%
MIP-3α<5%<25%<5%<20%
IL-12 (p70)<10%<20%<6%<15%
IL-13<5%<20%<5%<20%
IL-17A<10%<20%<5%<20%
IL-1β<5%<20%<5%<15%
IL-2<5%<25%<5%<15%
IL-21<10%<20%<5%<15%
IL-4<10%<20%<5%<15%
IL-23<5%<20%<5%<20%
IL-5<10%<25%<5%<20%
IL-6<10%<20%<5%<20%
IL-7<10%<20%<5%<15%
IL-8<10%<25%<5%<15%
MIP-1α<5%<20%<5%<15%
MIP-1β<5%<20%<5%<15%
TNFα<10%<20%<5%<15%
表3.384孔和96孔规格的分析间和分析内精密度。

分析灵敏度比较——384孔 PK 96孔

基于最低检测浓度(MinDC)+2SD（表4），大多数试剂盒的分析灵敏度均低于1 pg/mL。panel的所有分析物标准曲线都具有较宽的线性范围（图1a和1b）。

分析物384孔(pg/mL)96孔(pg/mL)
ITAC/CXCL111.791.98
GM-CSF1.680.60
Fractalkine/CX3CL121.4412.53
IFNγ0.690.94
IL-101.750.93
MIP-3α/CCL201.981.39
IL-12 (p70)0.510.27
IL-130.300.34
IL-17A/CTLA81.150.52
IL-1β0.550.24
IL-20.520.30
IL-210.330.20
IL-42.681.84
IL-2313.735.11
IL-50.520.22
IL-60.240.17
IL-71.110.60
IL-8/CXCL80.310.25
MIP-1α/CCL34.451.28
MIP-1β/CCL31.440.98
TNFα0.500.21
表4.最低检测浓度(minDC)+2SD，384孔(n=12) PK 96孔(n=7)试剂盒(pg/mL)。

样本检测

测试可检测样本，比较384孔和96孔规格的可检测样本比例。采用8份健康供体血清样本和8份健康供体血浆样本，总共16份样本测试试剂盒的灵敏度。低水平炎症与无数的临床和亚临床疾病有关，但针对健康个体的低水平细胞因子检测仍是一大难题。分析两种试剂盒对健康供体血清和血浆中低水平细胞因子的检测情况。

两种试剂盒对分析物的检测比率相近。表5显示可检测样本的数目（按分析物逐个计数），表6显示384孔与96孔规格的可检测样本比例。

分析物384孔96孔
ITAC/CXCL111616
GM-CSF1415
Fractalkine/CX3CL11615
IFNγ1616
IL-101515
MIP-3α/CCL201516
IL-12 (p70)1515
IL-131414
IL-17A/CTLA81615
IL-1β1415
IL-2138
IL-211515
IL-41413
IL-231615
IL-51315
IL-61616
IL-71616
IL-8/CXCL81616
MIP-1α/CCL31515
MIP-1β/CCL31616
TNFα1616
表5.384孔和96孔规格的样本可检测性比较(n=16 healthy controls)。
样品总数(16*21=336)总计% 总计
384孔31794.3
96孔31393.2
表6.384孔与96孔规格的样品检测总数(n=16 healthy controls)和可检测样品比例的对比。

样品相关性见图3，384孔和96孔试剂盒对于选定分析物具有高样品相关性。

图示384孔和96孔MILLIPLEX® Human High Sensitivity T Cell Panel对选定分析物(IL-10, TNFα, IL-6, MIP-1α, IL-1β, ITAC)的样品相关性（n=16，血清和血浆样品）。

图 3.384孔和96孔试剂盒对于选定分析物的样品相关性（n=16，血清和血浆样品）。

384孔的象限性能

按348孔板的四个象限范围，测定特定分析物的标准值。低和高浓度分析物对照品（质控品1和2，QC1和QC2）的数值一致（图4）。

图示384孔MILLIPLEX® Human High Sensitivity T Cell Panel在四个象限范围中的分析物(IFNƴ, IL-8, IL-6, TNFα)对照值。

图 4.384孔试剂盒在四个象限范围中的分析物对照值。

384孔试剂盒优势

低水平的炎症反应与多种临床和亚临床疾病状态有关。因此，研究细胞因子的低水平表达有助于更加深入地了解免疫系统和免疫细胞介导的炎症反应。我们的384孔MILLIPLEX® Human High Sensitivity T Cell Panel的优势包括经过验证的分析方法和出色的分析性能，以及多达182份重复样品的高通量分析，其优于96孔的38份重复样品，并含有标准曲线和重复质控品。

该试剂盒让研究人员在生物学相关背景下不仅能研究细胞因子的低水平表达，还能进行细胞因子分泌的多重同步定量分析。多角度的试验证明了384孔的性能与我们熟知的96孔试剂盒相当。拥有FLEXMAP 3D®或xMAP® INTELLIFLEX系统的科研人员即可使用MILLIPLEX® 384孔试剂盒，每天能提高约17,000个数据点的通量。

材料

浏览我们的各种384孔和96孔MILLIPLEX® Human High Sensitivity T Cell Panel。

描述384孔试剂盒96孔试剂盒
可自行选择分析物配置，最多21种分析物HSTC384-28KHSTCMAG-28SK
13重预混试剂盒-

HSTCMAG28SPMX13

13重预混试剂盒（bulk散装）-HSTCMAG28PMX13BK
21重预混试剂盒HSTCMAG384-PX21HSTCMAG28SPMX21
21重预混试剂盒（bulk散装）HSTCMAG384PX21BKHSTCMAG28PMX21BK

仅供研究使用，不可用于诊断。

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参考文献

1.
2019. Leading Causes of Death.. [Internet]. Centers for Disease Control and Prevention.: Available from: https://www.cdc.gov/nchs/fastats/deaths.htm
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