MILLIPLEX®小鼠高灵敏度T细胞多重检测试剂盒的生物学评价
许多疾病都与炎症有关，因而细胞因子的表达分析在疾病研究中占有重要地位。本文阐释了MILLIPLEX® Mouse High Sensitivity T Cell Multiplex Panel（小鼠高灵敏度T细胞多重检测试剂盒）的应用评价，包括生物学相关背景下的细胞因子低水平表达研究，以及细胞因子分泌的多指标并行的定量分析。
炎症与细胞因子的研究意义
多种临床和亚临床疾病状态都涉及低水平的炎症反应，比如自身免疫性疾病、代谢疾病和癌症。因此，细胞因子低水平表达研究的意义重大，有助于更加深入地了解免疫系统及其对大多数抗原多方面的应答反应，特别是免疫细胞介导的炎症反应。细胞因子的皮克级检测对于了解其致病性尤为重要。对于模式生物，比如小鼠，面临样本可用性和细胞因子低水平检测方面的独特挑战。
评价小鼠高灵敏度T细胞多重检测试剂盒
我们专门开发了一种小鼠高灵敏度T细胞多重检测Panel（液相芯片试剂盒），运用Luminex® xMAP®液相悬浮芯片技术，可同时分析多达18种小鼠细胞因子。只需25µL样品就能对小鼠进行18种细胞因子水平分析，既能体外使用PMA、PHA、脂多糖(LPS)、Con-A或钙离子载体刺激的外周血单个核细胞(PBMC)培养基样本，也能体内使用LPS刺激的小鼠、肥胖小鼠模型和衰老小鼠模型的血清样本。
一般来说，小鼠PBMC对体外刺激剂的应答反应难于研究，因为分泌的细胞因子水平过于低下。MILLIPLEX®小鼠高灵敏度T细胞检测试剂盒可有效检测不同的刺激剂引起的细胞因子变化。对于LPS刺激小鼠（炎症早期）、肥胖型小鼠（OB/OB和DB/DB）和衰老小鼠模型（幼年小鼠PK老年小鼠的细胞因子谱），该试剂盒还能对其体内低水平的血清细胞因子进行检测。
免疫检测方案
采用96孔板进行多重检测。详细步骤如下：
- 用150 µL洗涤缓冲液润湿微孔板10分钟并干燥。
- 加入50 µL标准品，或25 µL样品和25 µL检测缓冲液。
- 在所有微孔中加入25 µL微球，4°C下孵育过夜。
- 微球洗涤三次，然后加入50 µL生物素化检测抗体混合液，室温孵育1小时。
- 加入50 µL链霉亲和素-藻红蛋白，再次室温孵育30分钟。
- 微球洗涤三次，加入150 µL鞘液，在Luminex®仪器上读数（此例中为Luminex® 200™系统）。
| 分析物 | 标准曲线 范围(pg/mL) | 灵敏度(pg/mL) |
|
| 线性(%) | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| GM-CSF | 6.1 - 25,000 | 5.33 | 6.5 | 4.6 | 102 | 66 | 119 | ||||||||
| IFNƴ | 6.1 - 25,000 | 0.15 | 3.9 | 3.3 | 97 | 68 | 130 | ||||||||
| IL-1α | 6.1 - 25,000 | 1.54 | 5.4 | 4.7 | 94 | 64 | 155 | ||||||||
| IL-1β | 6.1 - 25,000 | 2.58 | 5.5 | 4.7 | 101 | 89 | 118 | ||||||||
| IL-2 | 6.1 - 25,000 | 0.80 | 4.8 | 6.0 | 89 | 105 | 98 | ||||||||
| IL-4 | 6.1 - 25,000 | 0.06 | 4.4 | 3.1 | 90 | 61 | 162 | ||||||||
| IL-5 | 6.1 - 25,000 | 0.53 | 6.1 | 2.9 | 85 | 82 | 84 | ||||||||
| IL-6 | 6.1 - 25,000 | 0.54 | 4.9 | 4.4 | 85 | 105 | 100 | ||||||||
| IL-7 | 6.1 - 25,000 | 0.98 | 7.6 | 7.0 | 95 | 113 | 75 | ||||||||
| IL-10 | 1.34 -5500 | 0.53 | 4.7 | 3.5 | 95 | 85 | 130 | ||||||||
| IL-12 (p70 ) | 6.1 - 25,000 | 1.29 | 3.6 | 3.9 | 91 | 89 | 111 | ||||||||
| IL-13 | 6.1 - 25,000 | 3.76 | 5.3 | 4.0 | 102 | 65 | 143 | ||||||||
| LIX | 6.1 - 25,000 | 2.70 | 3.9 | 3.7 | 95 | 92 | 126 | ||||||||
| IL-17A | 6.1 - 25,000 | 0.18 | 4.0 | 3.4 | 91 | 108 | 98 | ||||||||
| KC | 6.1 - 25,000 | 0.45 | 5.0 | 7.3 | 82 | 78 | 140 | ||||||||
| MCP-1 | 6.1 - 25,000 | 3.00 | 3.5 | 3.4 | 94 | 122 | 99 | ||||||||
| MIP-2 | 6.1 - 25,000 | 9.06 | 5.3 | 4.6 | 99 | 29 | 181 | ||||||||
| TNFα | 6.1 - 25,000 | 0.41 | 5.1 | 4.1 | 93 | 132 | 97 | ||||||||
表1.MILLIPLEX®小鼠高灵敏度T细胞试剂盒对18种分析物的所有标准曲线范围、灵敏度、精密度、准确度和线性。
图 1.MILLIPLEX®小鼠高灵敏度T细胞试剂盒全部18种分析物的标准曲线。
小鼠PBMC分析物检测
这款高灵敏度试剂盒可对小鼠PBMC培养基中的低水平分析物进行检测，如表2所示。
| PBMC培养基(pg/mL)* | GM-CSF | IFNγ | IL-1α | IL-1β | IL-2 | IL-4 | IL-5 | IL-6 | IL-7 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 未刺激细胞 | 13.8 | 2.61 | 30.1 | 0 | 0 | 0.23 | 0 | 53 | 5.89 |
| (+) PMA | 10.3 | 2.12 | 26.0 | 4.35 | 0 | 0.18 | 1.04 | 71 | 4.05 |
| (+) PHA | 10.3 | 2.33 | 23.9 | 0 | 0 | 0.23 | 0 | 59 | 5.43 |
| (+) Con A | 11.3 | 3.74 | 29.6 | 0 | 0 | 0.21 | 0 | 56 | 5.84 |
| (+) LPS | 12.3 | 3.39 | 33.2 | 14.35 | 0 | 0.24 | 1.15 | 728 | 2.75 |
| (+) A21387 | 10.3 | 2.22 | 17.8 | 0 | 0 | 0.17 | 0 | 51 | 2.62 |
| (+)上述所有各项 | 54.9 | 4.77 | 40.2 | 6.13 | 1.8 | 0.30 | 4.05 | 544 | 4.24 |
| PBMC培养基(pg/mL)* | IL-10 | IL-12 (p70) | IL-13 | LIX | IL-17A | KC | MCP-1 | MIP-2 | TNFα |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 未刺激细胞 | 6.7 | 0 | 8.2 | 109 | 0.94 | 156 | 33 | 491 | 8.6 |
| (+) PMA | 24.2 | 0 | 10.4 | 134 | 1.35 | 216 | 110 | 803 | 12.2 |
| (+) PHA | 7.2 | 0 | 13.3 | 99 | 7.02 | 154 | 27 | 463 | 8.9 |
| (+) Con A | 8.9 | 0 | 8.2 | 104 | 23.99 | 137 | 65 | 405 | 8.4 |
| (+) LPS | 40.6 | 0 | 14.1 | 515 | 1.1 | 3,937 | 97 | 12,053 | 204.9 |
| (+) A21387 | 4.9 | 0 | 4.3 | 97 | 0.46 | 154 | 21 | 462 | 8.4 |
| (+)上述所有各项 | 119.4 | 0 | 18.0 | 656 | 25.08 | 4,266 | 951 | 19,470 | 318.4 |
| *各种试剂刺激24小时后，小鼠PBMC培养基中的细胞因子水平。 | |||||||||
表2.MILLIPLEX®小鼠高灵敏度T细胞试剂盒可检测小鼠PBMC培养基中的低水平分析物。PBMC(Bioreclamation)解冻、洗涤，并用含10% FCS和1%青霉素/链霉素的RPMI培养基(Gibco)重悬至106细胞/mL。PBMC按106细胞/孔分装，37°C过夜孵育。次日，分别加入PMA、A23187、LPS、Con A、PHA或以上所有刺激剂，最终浓度分别为0.025、0.01、1、5或20 µg/mL。在不同时间点采集该刺激后培养基，15,000 RPM离心10 min，所得无细胞上清在多重检测前-80°C冻存。
LPS体内刺激后的血浆细胞因子水平
LPS体内刺激后的血浆细胞因子水平数据见图2。
图 2.LPS体内刺激的小鼠血浆样本来自Bioreclamation公司。CD-1小鼠按1 mg/kg剂量腹腔注射(IP)1 mg/mL的大肠杆菌(055:B5)LPS的生理盐水悬液。在不同时间点，每只小鼠采集约0.5 mL血浆（EDTA钠盐），多重检测前-80°C存放。
糖尿病小鼠模型
多重检测试剂盒对糖尿病小鼠模型的检测数据如图3所示。
图 3.糖尿病小鼠模型数据。肥胖小鼠OB/OB不能产生抑制饥饿的瘦素。糖尿病肥胖小鼠DB/DB中的瘦素受体失活。OB/OB、DB/DB和C57Bl/6对照小鼠来自于Bioreclamation IVT公司（纽约韦斯特伯里）。
衰老小鼠模型
多重试剂盒对衰老小鼠模型的检测数据见图4。
图 4.衰老小鼠模型数据。C57Bl/6对照小鼠来自于Bioreclamation IVT公司（纽约韦斯特伯里）。幼年小鼠4个月大，老年小鼠20至22个月大。
使用MILLIPLEX®小鼠试剂盒进行强大的细胞因子谱分析
MILLIPLEX®小鼠高灵敏度T细胞磁珠试剂盒为研究人员提供了一种经过验证的切实可行的检测方法，不仅可用于细胞因子的低水平表达检测，还能用于多种细胞因子分泌水平的同步定量分析，并且可在生物学相关背景（体内）下实行。该试剂盒可对18种（可调）小鼠细胞因子进行检测，每种样品仅需25 µL。
文中的代表性数据证明了该试剂盒的多功能化价值，其对相关细胞因子生物标志物的研究，不仅可针对体外刺激后的PBMC，还可用于体内研究，包括LPS刺激模型的早期炎症检测，以及代谢性疾病和衰老动物模型的研究。MILLIPLEX®小鼠高灵敏度T细胞磁珠Panel是对生物样本进行细胞因子谱分析的强大工具。
关于实验室、伴生和农业动物研究的多重检测产品，参阅我们的兽医学和动物健康研究的多重检测文章。
仅供研究使用，不可用于诊断。
如要继续阅读，请登录或创建帐户。
暂无帐户？
