感应染料

Monika Baeumle

BioFiles 2011, 6.3, 23.

一氧化氮探针

1998 年，R.F.Furchgott, L.J.Ignarro和F. Murad因发现一氧化氮 (NO) 是心血管系统中的信号分子而获得诺贝尔生理学或医学奖。这彰显了科学界对于一氧化氮作为神经元、内皮细胞和免疫系统信号转运分子的重视程度。NO 与血管舒张¹、神经传递²、细胞毒性、免疫应激³和炎症有关。^4-6

在存在分子氧、四氢生物蝶呤、NADPH 和黄素辅助因子的条件下，一氧化氮合酶 (NOS) 可在细胞内催化精氨酸转化为瓜氨酸和 NO。N^ε-羟基-L-精氨酸是该反应的中间体。NO 的体内半衰期仅为几秒；⁷但这种成分可溶于水性介质和亲脂性介质，因此可轻松透过细胞质和细胞膜扩散。NO 影响着中枢神经系统的神经元传递和突触可塑性。NO 可激活血管系统中的鸟苷酸环化酶，增加 cGMP 合成量，进而诱导平滑肌松弛和血管舒张。NO 的毒性源于其可与超氧阴离子结合形成过氧亚硝酸盐，过氧亚硝酸盐是一种氧化自由基，会损害 DNA 和其他细胞成分。

NO 分子不稳定，在生物系统中的浓度非常低。为实时检测 NO 分子，需要兼具高灵敏度和特异性的方法。如果能找到合适的 NO 探针，荧光显微镜不失为首选方法。这种高时空分辨率技术可对原位 NO 浓度进行可靠成像。

针对灵敏的 NO 探针设计进行深入研究发现，一种涉及邻位芳香族二氨基化合物^8,9的反应可选择性捕获和检测 NO。图 1 以新型 NO 探针 5,6-二氨基荧光素二乙酸酯 (DAF-2-DA) 为例展示了该反应。

图 1.胞内 NO 测量原理（DAF-2 DA 探针[10]）。亲脂性、不发荧光的 DAF-2-DA 可透过细胞膜，然后被胞质酯酶水解成发弱荧光的 DAF-2 探针。存在 NO 自由基条件下，可转化为发强荧光的三唑荧光素（DAF-2T）。

萘类

2,3-二氨基萘 (DAN) 一度被视作体外和生理条件下测量 NO 浓度的灵敏探针，¹¹在低 nM 浓度范围内，检测到对应的 2,3-萘三唑 (NAT)。但 DAN 上样后会透过细胞膜快速泄漏，经证不适合胞内 NO 检测。 DAN 激发和发射波长极短，在生物基质中也会出现高背景荧光。

因此，业内开发了 DAN-1及其细胞膜透过性前体 DAN-1-EE。¹²DAN-1 由胞质酯酶水解 DAN-1-EE 形成。DAN-1-T（图 2）是 DAN-1 与 NO 的荧光反应产物，泄漏现象表现出明显改善。

图 2.加入终浓度分别为 5 mM（绿线）或 50 mM（红线）的 NO 成形剂 (NONOate) 后，从 DAN-1 形成发荧光的 DAN-1-T 的时程 [12]。

氧杂蒽

人们开发了基于荧光素和罗丹明的探针，以克服萘类 NO 探针的部分缺点，如细胞毒性、强自发荧光、消光系数小、在中性缓冲液中溶解度差以及激发/发射波长短。^10,13-16

在没有吸附副产物的情况下，DAF-2 对 NO 的体外检测限 (LOD) 为 5 nM。NO 的氧化形式（例如 NO^2-和 NO^3-）及活性氧（例如 O^{2 ·-}、H₂O₂ 和 ONOO^-和 ONOO-）不会与 DAF-2 反应生成荧光产物。因此，在生理条件下，仅在 NO 存在时形成发荧光的 DAF-2 T 。

存在内毒素和细胞因子的情况下使用共焦激光扫描显微镜观察上料 DAF-2-DA 的培养平滑主动脉肌细胞，检测到荧光反应。加入 L-精氨酸会导致荧光信号急剧增加，而补充加入 N-单甲基-L-精氨酸 (L-NMMA) 不会导致信号增加，这清洗证明了 NO-合酶的抑制作用。

荧光素型探针 (DAF-2) 表现出明亮的荧光信号，而罗丹明类探针（DAR-1 和 DAR-2）具有高光稳定性和广泛的 pH 适用范围（表 1、表 2 和图 3）。

数据来自参考文献。¹¹
20 °C，0.1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 条件下的数据；通过与罗丹明 B 在乙醇中的已知量子产率进行比较，得出实际荧光量子产率。

数据来自参考文献。 17^10-12
基于暴露在阳光下 3 小时后的测得荧光强度。

图 3.DAF-2（绿光）、DAR-1（橙光）和 DAR-2（粉光）的荧光强度 (a.u.) 的 pH 依赖性[11]。

氧气探针

氧分子检测在许多应用和生物过程中发挥着重要作用。这类探针是氧敏感指示剂，在与分子氧结合后会改变其荧光强度或最大发射光谱。感应剂可逆且可稳定耐受光淬灭。

ROS探针

活性氧探针 (ROS) 可应用于炎症和癌症等许多疾病研究——这类疾病状态下的细胞产生的 ROS 水平增加。ROS 研究需要具有超低自氧化和低副产物产生率的光稳定传感器。¹⁷

产品列表

参考文献

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