酵母转化实验方法

酵母转化实验方法

实验方法概览

LiAc转化方法涉及到三个主要的步骤：制备感受态酵母细胞、用质粒DNA进行转化以及随后的铺板以进行转化子选择。酵母转化子通常是通过使用营养缺陷型标记而进行选择的；因此，应使用合适的合成缺陷型培养基进行转化子筛选。

所需试剂：

储备溶液
50%聚乙二醇溶液（分子量~36,500）
1 M Tris-HCl和0.2 M EDTA，pH 8.0（TE缓冲液）（货号T9285）
1 M醋酸锂，pH 7.5（货号L4158）

1x TE-LiAc溶液
含1 mM EDTA和0.1 M醋酸锂的10 mM Tris-HCl，pH 8.0

PEG-TE-LiAc溶液
溶于含1 mM EDTA和0.1 M醋酸锂的10 mM Tris-HCl，pH 8.0的40 % PEG

酵母转化

1. 制备YPD和合成完整（SC）缺陷型培养基平板，并分别对其进行高压灭菌（表1和2）。
2. 从平板中挑取酵母细胞至在100 mL无菌烧瓶中的20 mL YPD培养基中。
3. 过夜摇晃培养。
4. 将上述培养物中的细胞进行稀释到100 mL YPD培养基中，直至OD600为0.3。
5. 轻轻沉淀细胞。
6. 用7-8 mL的1x TE-LiAc溶液进行重悬并在23 °C旋转1-1.5小时。
7. 向转化专用的无菌微型离心管中加入10 µL的10 mg/ml鲑鱼睾丸DNA（货号D9156），另设置一组阴性对照。
8. 向每管中加入0.1 µg的酵母质粒DNA（待研究的）以及100 µL的感受态细胞，并涡旋。
9. 加入600 µL新鲜制备的PEG-TE-LiAc溶液，涡旋后在30 °C孵育30分钟，并轻轻摇晃。
10. 可选 - 可加入10% (v/v)的DMSO（货号D8418）；随后在42 °C热激15分钟。
11. 离心3秒，用无菌水重悬细胞并使用适当的SC缺陷型培养基进行铺板。
    

注意：可参考铺板酵母的生长实验方法以及以下章节进行转化子分离。

酵母转化子的分离

酵母转化子通常是采用URA3互补法进行选择的，尽管也可以使用利用氨基酸进行互补的技术和蓝白斑筛选方法。

在基于URA3的选择技术中；质粒DNA通过都含有正常拷贝的酵母URA3基因以及URA3启动子；然而，酵母突变株缺乏URA3等位基因。因此，用质粒转化后的酵母细胞含有了URA3基因的功能性拷贝，使得它们能够在补充了尿嘧啶（货号Y1501）的酵母合成缺陷型培养基中进行生长。