过氧化物酶的酶学测定（EC 1.11.1.7）

单位定义：一个单位的过氧化物酶在pH 6.0、20 ℃下，在20秒钟内从连苯三酚形成1.0毫克红陪酚。该单位等同于在25 °C每分钟~18 µM单位。

注意事项

有关危险和安全处理方法的信息，请参阅材料安全数据表。

所需试剂和设备

1.0 M磷酸氢钾溶液（货号：P8709）

1.0 M磷酸氢二钾溶液（货号：P8584）

过氧化氢 30% (w/w)溶液（货号H1009）

连苯三酚（货号254002）

比色皿和恒温分光光度计

制备说明（存储 / 稳定性）

使用超纯水（25 °C时 ≥ 18 MΩ×cm电阻率）制备试剂。

磷酸盐缓冲液（100 mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0，20°C）— 加入17.36 mL的1.0 M磷酸氢钾溶液（货号P8709）。加入2.64 ml的1.0 M磷酸氢二钾溶液（货号P8584）并用超纯水调整至200 ml的终体积。用1 N KOH或1 N HCl在20℃下调节至pH 6.0。将磷酸盐缓冲液储存在冰上。

过氧化物溶液（0.50％ [w/w] 过氧化氢[H₂O₂] 溶液）— 使用过氧化氢，30% (w/w) 溶液（货号H1009）在超纯水中制备1:60稀释液。

注意：制备新鲜稀释液用于对照和样品，并将溶液储存在加盖的4打兰小管中，置于冰上，避免暴露于空气。

连苯三酚溶液（5％ [w/v] 连苯三酚溶液）— 用连苯三酚（货号254002）和超纯水在琥珀色（或用铝箔包裹的）小管中制备50 mg/mL溶液。

注意：现配现用，并将此溶液避光保存在冰上。

过氧化物酶溶液 — 在冷的磷酸盐缓冲液中制备10 mg/ml过氧化物酶溶液。在冷的磷酸盐缓冲液中制备含有0.45-0.75单位/ml过氧化物酶的工作溶液，现配现用。

注意：10 mg/ml原液可用于RZ因子测定。

操作流程

最终测定浓度 — 在3.00 mL反应混合物中，最终浓度为14 mM磷酸钾，0.027％（v/v）过氧化氢，0.5％（w/v）连苯三酚，和0.45-0.75单位过氧化物酶。

注意：一次只运行一个比色皿，因为最大速率出现在第一分钟。

1.移取以下试剂到合适的比色皿中：

2.倒置混合，并在适当恒温的分光光度计中平衡至20 ℃约10分钟。

注意：所有比色皿可同时孵育，但一次只读取一个比色皿。

3.然后添加：

4.立即通过倒置混合，并记录3分钟内的A₄₂₀增量。对于所有测试和空白样，使用最大线性速率或0.5分钟间隔获取DA₄₂₀/20秒。

适用性标准：DA₄₂₀/20秒比率应在0.18-0.34之间。必要时可对酶浓度进行修改。

结果

计算

1.

式中：
3 = 测定的体积（以毫升计）
df = 稀释因子
12.0 = 1 mg/ml红陪酚在420 nm处的消光系数（内部测定）
0.1 = 使用的酶体积（以毫升计）

2.    

3.