纤维素酶的酶学测定

1.目标

标准化纤维素酶酶学测定程序。

2.适用范围

该程序适用于所有纤维素酶和半纤维素酶产品。

3.定义

3.1 方法：光谱法终止测定

3.2 条件：T = 37°C，pH = 5.0，Abs340nm，光程 = 1cm

3.3 ATP = 腺苷5'-三磷酸

3.4 ADP = 腺苷5'-二磷酸

3.5 β-NAD = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化形式

3.6 β-NADH = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原形式

3.7 G-6PDH = 葡萄糖6-磷酸脱氢酶

3.8 G-PG = 6-磷酸-D-葡糖酸盐

3.9 纤维素 + H2O纤维素酶 > D-葡萄糖

3.10 D-葡萄糖 + ATP己糖激酶 > D-葡萄糖6-磷酸盐 + ADP

3.11 D-葡萄糖6-磷酸盐 + β-NAD G-6PDH > 6-PG + β-NADH

3.12 单位定义：在pH 5.0，37℃条件下，一个单位在一个小时内可从纤维素中释放1.0 μmole葡萄糖（孵育时间为2小时）。

3.13 最终检测浓度：在5.00 ml反应混合物中，最终浓度为40 mM乙酸钠、4%（w/v）Sigmacell纤维素和2-6单位纤维素酶。

4.讨论

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5.责任

经过培训的分析服务、新产品支持和研发人员有责任遵循本书面程序进行操作。

6.安全

有关危险和适当的操作注意事项，请参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1 试剂

7.2 材料 / 设备

7.3 相关操作程序

N/A

7.4 溶液制备

7.4.1   50 mM乙酸钠缓冲液，pH 5.0，37°C

7.4.1.1    用去离子水溶解1.36 g乙酸钠三水合物（货号S8625）制备200 mL溶液。用 1 NHCl（货号H3162） 在 37ºC 将pH调至 5.0。

7.4.2 5％（w/v）Sigmacell溶液（Sigmacell）

7.4.2.1 将5 g Sigmacell微晶20型（货号S3504）溶于50 mM乙酸钠缓冲液制备100 ml溶液。轻轻混合并加热，使悬液均匀。

7.4.3 葡萄糖（HK）测定小管

7.4.3.1 使用葡萄糖（HK）检测剂（货号G3293）。按照标签说明溶解内容物。

7.4.4 纤维素酶溶液（纤维素酶）

7.4.4.1    临用现配，用冷的去离子水制备2-6单位/ml纤维素酶溶液。

7.5 方法：

7.5.1   移取（以毫升计）以下试剂至一次性硅硼酸玻璃培养管中：

7.5.1.1    平衡至37 °C。

7.5.1.2    然后添加：

7.5.1.3 立即涡旋混合试样和空白。使用摇床以中速在37℃下孵育试样和空白120分钟整。

7.5.1.4    立即将试样和空白转移到冰浴中。静置每个管，直到悬液沉淀。以约4000 rpm速度离心约2分钟以澄清。使用步骤7.5.2.2中的上清液。

7.5.2 移取（以毫升计）以下溶液至适当的比色皿：

7.5.2.1    平​​衡至25ºC。使用适当的恒温分光光度计监测A_340nm直至恒定。记录试样和空白的初始A_340nm。

7.5.2.2    然后添加：

7.5.2.3    立即倒置混合，并记录完成前的A_340nm增量（约5分钟）。获得试样和空白的最终A_340nm。

7.6 计算

7.6.1    ΔA_340nm 试样 = A_340nm 最终试样 – A_340nm 初始试样

7.6.2    Δa340nm_340nm 空白 = A_340nm 最终空白 – A_340nm 初始空白

7.6.3.1 3.1 = 步骤7.5.2的最终体积（以毫升计）

7.6.3.2 5 = 步骤7.5.1的反应混合物的总体积（以毫升计）

7.6.3.3 DF = 稀释因子

7.6.3.4 6.22 = 在340 nm处的毫摩尔β-NADH消光系数

7.6.3.5 2 = 根据单位定义，从2小时换算成1小时的换算系数

7.6.3.6 1 = 步骤7.5.1中使用的纤维素酶的体积（以毫升计）

7.6.3.7 0.1 = 步骤7.5.2中使用的步骤7.5.1的体积（以毫升计）

8.参考文献和附件

8.1 附件：报告范本

8.2 参考文献：Worthington, C.E.(1988) Worthington Enzyme Manual, pp76-79, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ

9审批

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