Duolink™多孔板检测

关于DUOLINK™荧光原位检测使用说明书的改动建议

使用Duolink™试剂染色多孔板培养细胞时，需要对适合玻片样本染色的Duolink™实验方案做一些改动，使其适合多孔板形式。其中，洗涤程序、成像准备和孔板扫描都与标准方案不同。在96孔多孔板中染色细胞时，建议仔细通读Duolink™荧光原位检测使用说明书，再按照下述指南修改实验方案。根据特别的应用需求或检测设计，也可进行其他改动。

推荐设备

• PerkinElmer^® ViewPlate 96孔板，黑色，底透（PerkinElmer，货号6005182，50/箱）或类似孔板
• 塑料多孔板盖、塑封膜或Parafilm^®封口膜
• 水平摇床，用于孵育和洗涤步骤
• Cellomics ArrayScan或其他高分辨率激光扫描显微镜
• Duolink™原位微孔板细胞核染色剂和抗淬灭剂(DUO82064)
• Duolink™原位微孔板传热块(DUO82065)

预处理，封闭和一抗

按照平时的免疫染色标准方案在多孔板中培养并处理（饥饿、刺激等）、洗涤和固定细胞。一抗条件的优化应综合考虑样本固定、抗原修复、封闭溶液、抗体稀释剂、浓度、孵育温度和时间。

孵育步骤

建议每孔加入40 μl试剂。孵育时，用塑料板盖、塑封膜或Parafilm封口膜盖住板子，防止样本变干。在预热的微孔板传热块(Heat Transfer Block)中孵育可提高染色效率和板间重复性，并减少微孔板边缘效应。建议孵育时将板子置于水平摇床上（最高 240 rpm），提高染色均匀性。

洗涤步骤

每次洗涤建议每孔至少加入200 μl 1x洗涤缓冲液。可手动洗涤，也可通过微孔板细胞清洗模块自动进行。加入新试剂前，尽量除尽残留洗涤缓冲液以避免干扰。同时也要保持样本不要过干，并确保洗涤不会过于剧烈以免细胞脱落。每次清洗后，让样本在洗涤缓冲液中浸泡一会后再弃液，例如，在 2 x 5 min清洗时：加液200 μl清洗并浸泡5 min，吸去液体，接着再加200 μl清洗并浸泡5 min再吸去液体，最后加入新试剂。在使用洗涤缓冲液B的最终洗涤步骤中，让样本在1x洗涤缓冲液B中浸泡2 x 10 min，再进行成像准备。

成像准备

为了进行DAPI细胞核染色并保护PLA信号，可使用含细胞核染色剂缓冲液(10x)和抗淬灭剂缓冲液(10x)的微孔板细胞核染色剂和抗淬灭剂试剂盒。完成1x洗涤缓冲液B的2 x 10 min最终洗涤后，即开始本节程序：

1. 将细胞核染色剂缓冲液升至室温。
2. 向小瓶加入9.0 mL超纯水，配成1x细胞核染色剂缓冲液。
3. 让样本在1x洗涤缓冲液A中浸泡2 min。
4. 弃去洗涤缓冲液，按50 μl /孔加入1x细胞核染色剂缓冲液。
5. 37 °C孵育30 min。孵育快结束时，将抗淬灭剂缓冲液升至室温。
6. 向小瓶加入9.0 mL超纯水，配成1x抗淬灭剂缓冲液。
7. 让样本在1x洗涤缓冲液A中浸泡2 min。
8. 弃去洗涤缓冲液，按50 μl/孔加入1x抗淬灭剂缓冲液。
9. 扫描微孔板。

为了防止液体随着长时间的扫描而蒸发，用塑封膜密封板子。扫描板应4 °C避光保存。4 °C储存的信号可维持一周。

孔板扫描

采用适合所用显微镜的扫描设置，并确保选用合适的滤光片用于图像采集。至少放大20倍。为了比较各孔数据，需要固定信号通道的曝光时间。扫描分辨率最好设为0.25 μm /像素，至少0.45 μm /像素。

384孔板相关建议

使用PerkinElmer^® ViewPlate 384孔板，黑色，底透（PerkinElmer，货号6007460，40/箱）或类似孔板，每孔至少15 μl试剂。由于TWEEN^® 20容易产生气泡清洗时要小心，采用TBS替代可能有所帮助。也可稍微离心一下板子去除气泡。移液时将板子置于冰上并在37 °C孵育时将板子置于微孔板传热块上预热，可以避免板内染色不均的问题。