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主页蛋白质与核酸的相互作用Duolink® PLA多色检测方案

Duolink® PLA多色检测方案

本方案描述了如何使用Duolink® PLA多色试剂同时检测、可视化和定量一个组织或细胞样本中多达4种的蛋白、蛋白修饰或蛋白互作。

材料与设备

Duolink® PLA试剂

Duolink® PLA多色检测实验需要以下Duolink® PLA多色产品:

  • 2至4种Duolink® PLA多色探针制备试剂盒(可选红色、绿色、橙色和/或远红)试剂盒包含:
    • Duolink® PLA多色寡核苷酸 2管冻干的活化寡核苷酸(用于偶联一抗)。
      红色寡核苷酸A红色寡核苷酸B
      绿色寡核苷酸C绿色寡核苷酸D
      橙色寡核苷酸F橙色寡核苷酸G
      远红寡核苷酸H远红寡核苷酸I
    • 偶联缓冲液 – 用于缓冲偶联反应
    • 终止剂 - 用于终止偶联反应
    • 储存液 - 用于保存寡核苷酸偶联抗体(PLA探针)

    注意:-20 °C保存所有试剂。特定的寡核苷酸对与一抗偶联的详细方法请参阅Duolink® PLA多色检测探针制备指南。抗体偶联后,将制备好的PLA探针保存在+2-8°C下。切勿冻存。

  • Duolink® PLA多色试剂套装。试剂盒包含:
    • 连接原液(5X) – 稀释配制1X连接缓冲液
    • 连接酶(1 U/μL) – 用于配制连接液
    • 扩增原液(5X) – 稀释配制1X扩增缓冲液
    • 聚合酶 (10 U/μL) - 用于配制扩增液
    • 封闭液 – 用于在孵育抗体前封闭样品
    • Probemaker PLA探针稀释剂– 用于稀释定制PLA探针
    • 检测原液(5X) – 稀释配制1X检测缓冲液

    注意:收到后,可将1X封闭液和1X Probemaker PLA探针稀释剂储存在2-8°C下。其他所有组分-20 °C储存。

  • 荧光用洗涤缓冲液 (A和B)
  • DAPI的Duolink®封片剂(用于载玻片,储存在+2-8°C)或者细胞核染色剂和抗淬灭剂(用于微孔板,储存在-20°C)

自备材料

  • 检测目标蛋白质的一抗。
  • 超纯水(无菌过滤,Milli-Q®或类似水质)
  • 载玻片样本(细胞或组织),已经过固定、修复和透化方面的预处理

设备

  • 荧光显微镜,带有适当的滤光片、照相机和图像采集软件
  • 37°C培养箱
  • 水平摇床
  • 温湿度箱或微孔板传热块
  • 疏水笔,用于给反应区域划界
  • 冰块(用于酶)
  • 染色罐
  • 镊子
  • 移液器和吸头(1 μl至1000 μl)
  • 盖玻片,适用荧光显微镜

DUOLINK® PLA多色检测方案

以下实验方案适用于1 cm2的载玻片样品,需要40 µL溶液充分覆盖。

可根据反应面积和样品数量调整溶液体积。所有孵育均应在湿度箱中进行。所有洗涤步骤均应在室温下使用至少70 ml洗涤缓冲液在染色罐中温和搅拌进行。

试剂准备

洗涤缓冲液A和B应在开始检测之前配制,将一袋溶解在高纯度纯水中,定容至1,000 mL。溶液短期(短于两周)室温存放,长期则+2-8 °C储存。

注意:使用前将溶液升温至室温。

  • 0.01X洗涤缓冲液B应在开始检测之前用超纯水1:100稀释1X洗涤缓冲液B配制。
  • 许多Duolink® PLA试剂以浓缩原液形式提供,应在临用前稀释。请勿储存稀释后的Duolink® PLA试剂。

Duolink® PLA多色实验方案

在开始之前,将样品沉积在载玻片上,并经过固定、恢复和/或透化方面的预处理。

  • 封闭
    注意:使用前拧紧1X封闭液的盖子,因为冻融过程中滴瓶盖可能会松脱。+2-8°C储存。
    • 每1 cm2样本滴加1滴(~40 µL)Duolink®封闭液。务必保证用封闭液完全盖住整个样本。
    • 在温湿度箱中37°C孵育载玻片60分钟。

  • 一抗孵育
    注意:在添加抗体之前请勿让载玻片干燥,否则会导致背景。
    • 用Probemaker PLA探针稀释剂一起稀释所有寡核苷酸偶联一抗。按照在单色Duolink® PLA检测中发挥最佳抗体性能的浓度稀释。
    • 拍掉玻片上的封闭液。
    • 每个样本加入一抗溶液。
    • 在湿度箱中孵育玻片。采用适合所有一抗的最佳孵育温度和时间。
    注意:直接检测(寡核苷酸偶联一抗)不一定能获得与间接检测(一抗和PLA探针试剂组合)相同的结果。可能需要做些额外优化。
  • 连接
    注意:
    连接酶要等到需要添加到样品中时再添加。确保连接缓冲液在使用前完全解冻。
    • 拍掉玻片上的一抗液体。
    • 用1x洗涤缓冲液A室温洗涤玻片3x5分钟。
    • 在洗涤过程中,配制连接液。涡旋混匀5x多色PLA连接缓冲液。
    • 超纯水1:5稀释5x多色PLA连接缓冲液并混匀。对于40 µL反应,将8 µL 5x连接缓冲液加到30 µL超纯水中(减去连接酶体积)。为所有样品制备足量的溶液。
    • 使用冰块恢复从冰箱里取出的连接酶(-20 °C)。
    • 用1x连接缓冲液1:20稀释连接酶并混匀。对于40 µL连接液,将2 µL连接酶加到38 µL 1x连接缓冲液中。
    • 拍掉多余的洗涤缓冲液,加入连接液。
    • 在预热的温湿度箱中37 °C孵育玻片30分钟。
    注意:连接酶也可用1x连接缓冲液1:40稀释,但相应地37 °C下的反应时间也要延长到60分钟。
  • 扩增
    注意:聚合酶要等到需要添加到样品中时立即添加。
    • 拍掉玻片上的连接液。
    • 用1x洗涤缓冲液A室温洗涤玻片3x5分钟。
    • 在洗涤过程中,配制扩增液。涡旋混匀5x扩增缓冲液。
    • 用超纯水1:5稀释5x扩增缓冲液并混匀。对于40 µL反应,将8 µL 5x扩增缓冲液加到31 µL超纯水中(减去聚合酶体积)。为所有样品制备足量的溶液。
    • 使用冰块恢复从冰箱里取出的聚合酶(-20°C)。
    • 用1x扩增缓冲液1:40稀释聚合酶并混匀。对于40 µL反应,将1 µL聚合酶加到39 µL 1x扩增缓冲液中。
    • 拍掉多余的洗涤缓冲液,加入扩增液。
    • 在预热的温湿度箱中37 °C孵育玻片100分钟。
  • 检测
    注意:多色PLA检测缓冲液对光敏感。需避光使用所有含缓冲液的溶液。
    • 拍掉玻片上的扩增液。
    • 用1x洗涤缓冲液A室温洗涤玻片3x5分钟。
    • 在洗涤过程中,配制检测液。涡旋混匀5x多色PLA检测缓冲液。
    • 用超纯水1:5稀释5x多色PLA检测缓冲液并混匀。对于40 µL反应,将8 µL 5x检测缓冲液加到32 µL超纯水中。为所有样品制备足量的溶液。
    • 拍掉多余的洗涤缓冲液,加入检测液。
    • 在预热的温湿度箱中37 °C孵育玻片30分钟。
  • 最终洗涤
    注意:试剂对光敏感。全程避光保护玻片。
    • 拍掉玻片上的检测液
    • 用1x洗涤缓冲液B室温洗涤玻片2x 10分钟
    • 用0.01X 洗涤缓冲液B洗涤玻片1分钟
  • 成像准备
    注意:Duolink®原位封片剂(含DAPI)是液态的,不会固化。可用干净的指甲油密封盖玻片和载玻片的边缘。避免在盖玻片下制造气泡。
    • 拍掉载玻片上多余的洗涤缓冲液。
    • 用尽可能少的Duolink® PLA封片剂(含DAPI)封住载玻片和盖玻片。
    • 静置15分钟后使用20倍物镜,在荧光或共聚焦显微镜中分析。

结果

图像采集

使用荧光显微镜,并根据检测荧光染料选用合适的滤光片,检查Duolink® PLA多色实验结果。Duolink® PLA信号表现为散落在细胞各个部位的荧光点(图1A)。每个信号为亚微米大小,可能处在多个焦平面上。因此,需要扫遍整个样本厚度来获得图像。注意,当进行直接检测的Duolink® PLA时(即剔除寡核苷酸偶联一抗时),不应检测到PLA信号。如有可能,应设置生物学对照(图1B)。

用EGF刺激SK-OV3细胞(A),或不做刺激作为生物学对照(B)。

图 1.用EGF刺激SK-OV3细胞(A),或不做刺激作为生物学对照(B)。不同颜色分别代表Duolink® PLA多色检测的EGFR-HER2相互作用(绿色)、EGFR磷酸化(橙色)和HER2磷酸化(远红)。细胞核用DAPI染色(蓝色)。

根据信号强度的不同,每种荧光染料的采集参数(曝光时间、增益等)也会不同。但切记在单次实验中,对所有样本都要采取针对每种荧光染料优化的相同的图像捕获参数。使用阳性和阴性对照可优化参数设置。当PLA信号数较多时,PLA信号会合并/重叠(图2)。这种情况在研究高表达蛋白或图像捕获过曝时都会发生。因此需要小心设置采集参数并采用合适的一抗滴度,以获得分散的PLA信号。

使用成像软件进行图像分析。

图 2.Duolink® PLA多色检测未刺激SK-OV3细胞中的EGFR(绿色)、HER2(橙色)和GAPDH(红色)。细胞核用DAPI染色(蓝色)。

PLA信号可通过多种图像分析工具定量。使用图像数据可分析PLA信号的平均荧光强度和/或每个细胞或细胞每个区域的PLA信号总数(图3)。定量结果表示为相对同一实验中技术和/或生物学对照的数值。不过只有当PLA信号没有重叠且像素未饱和时,才有可能进行可靠定量。

Duolink® PLA多色检测的EGFR

图 3.使用成像软件进行图像分析。DAPI染色核(蓝色)自动检测,细胞质大小由用户推算(绿线区域)。PLA信号(红色)代表目标蛋白。分析时,对白点标记的PLA信号和黄线框选的细胞核进行定量。

材料
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参考文献

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