标准PCR实验方案
如何进行PCR
标准的聚合酶链式反应（PCR）实验流程包括四个步骤：
- 向PCR管中加入所需试剂或预混液及模板。
- 混合并离心。
*若热循环仪无加热盖，需加入矿物油以防止挥发。 - 根据热循环仪和引物的参数进行扩增。
- 通过琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙锭染色，对扩增的DNA进行检测。
下文将更详细地介绍这些步骤，并提供有关材料和试剂选择的建议。这是一个使用Taq DNA聚合酶的基本PCR实验方案。
PCR步骤与必备组件
PCR反应的故障排除涉及诸多因素。观看本动画，了解如何根据您的需求选择合适的试剂和循环条件，从而获得最佳结果。
有关其他聚合酶或高级PCR技术的更多实验方案，请参阅我们的《PCR技术指南》中的“实验方案”部分。
请访问我们的“PCR基础知识”页面，进一步了解标准PCR，包括其定义等内容。
试剂：PCR 需要哪些材料？
什么是Taq聚合酶？
Taq DNA聚合酶是一种源自嗜热菌Thermus aquaticus的耐热酶。它通常用于PCR中DNA片段的扩增。该酶为重组形式，在大肠杆菌中表达。它能够承受反复加热至95 °C（这是PCR技术所要求的），且不会显著丧失活性。 经SDS-PAGE电泳测定，该酶的分子量约为94 kDa，且未检测到内切酶或外切酶活性。它具有5'→3' DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性。 每批Taq DNA聚合酶均经过PCR扩增和双链测序测试。该酶以5单位/µL浓度提供，并配有优化的10×反应缓冲液。
标准 Taq DNA 聚合酶
请参考下表，根据您的反应条件选择合适的Taq DNA聚合酶组合。可从透明或红色染色的制剂中选择，这些制剂有含氯化镁（MgCl₂）和不含氯化镁的两种版本，也可选择预先配制的含缓冲液和dNTPs的预混液或主混合液。
*缓冲液和Taq聚合酶组合购买：D1806、D4309 或 D4545
预混PCR反应体系
2. 用涡旋混合器轻轻混匀，然后短暂离心，使所有组分沉淀至试管底部。
注意：若使用无加热盖的热循环仪，请在每个试管顶部加入 50 µL 矿物油以防止蒸发。
3. 进行扩增。扩增参数将根据所用的引物和热循环仪而有所不同。可能需要针对具体的引物、模板和热循环仪对系统进行优化。
典型循环参数
建议进行 25-30 个扩增循环。
4. 扩增后的DNA可通过琼脂糖凝胶电泳及随后的溴化乙锭染色进行检测。
注：矿物油上层可通过单次氯仿萃取（1:1）去除，从而回收水相。
核酸电泳试剂
- 琼脂糖（预制凝胶、粉末等）
- 缓冲液，如MOPS-EDTA-乙酸钠、Tris-乙酸-EDTA（TAE）或Tris-硼酸-EDTA（TBE）
- RNA用凝胶上样溶液和样品上样缓冲液
- 电泳染色剂或染料，如溴化乙锭
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