生物药物表征

生物制剂和生物类似药的表征与分析

生物药物需要通过高度复杂的分析流程进行分析和表征，其重点在于GMP和监管合规性。生物原研药或生物类似药(biosimilar)的开发都需要进行产品表征研究，以确保获得可靠合格的生物药物。

鉴定

完整质量测定

完整分子量测定，通常采用SEC-MS法（体积排阻色谱/质谱）和相应的标准品，是从克隆选择到成品验证中生物制剂表征的必备步骤。完整分子量分析通常用于证明蛋白质/多肽产物的多样性，验证生物制剂的特性。经优化还可用于确定所有蛋白质产品的完整分子量，包括双特异性单克隆抗体。

蛋白质消化分析法则无需处理过于庞大的完整大蛋白，而是先将蛋白样品切成片段，接着配合专用的质谱蛋白质组学标准品分别进行分离。

滴度测定

细胞株是否能生产足够产量的单抗，会影响其商业潜力。以滴度作为衡量的基准指标，通过蛋白A亲和色谱法(HPLC)测定。在单抗开发初期，要对大量的细胞培养收获物(HCC)样品进行IgG滴度筛选。采用蛋白A配体的亲和色谱法通常用于测定单抗的浓度，并对其进行纯化，以便用于下游的聚集体和电荷异构体分析。

氨基酸分析

氨基酸分析用于测定单抗的氨基酸组成，是产品鉴定的流行方法。通常与消光系数测定配合进行，消光系数是在确定不同产品滴度的常用方法。

有证标准物质(CRM)具有计量学上有效程序确定的特性值，采用这种标准品可最大限度地减少和控制所有氨基酸分析流程（包括蛋白质提取、分离、富集、蛋白水解和分析）中的实验变异。

肽图分析

简单的单种酶解肽图分析足够用于初步鉴定单抗。更详细的治疗性抗体表征，包括N端和C端（氨基酸）测序、聚糖检定和其他抗体生产、分析、纯化和片段化，可提供更多的产品结构信息。蛋白质组学质谱也可提供额外的结构信息。

翻译后修饰

N-聚糖分析

糖基化复杂多变，可能会影响mAb的纯度，产生变异功能。单克隆抗体骨架上带有N-聚糖，可通过LC-MS释放出来，以评估其糖基化模式。N-聚糖表征是获得单克隆抗体完整结构信息的必备分析。认识这些N-聚糖途径非常重要，因为N-聚糖会影响聚糖结合蛋白的识别和糖蛋白的构象、溶解性、抗原性等特性。

单克隆抗体高级结构比较

许多因素都会影响单抗的高级结构(HOS)（三维结构），包括从单抗生产的细胞系选择到生物工艺条件，比如温度、pH和光暴露。单抗三级结构的深入研究可采用氢氘交换质谱法(HDX-MS)。

单抗修饰分析

单抗生产过程中会发生各种不同的翻译后修饰，培养基、温度等工艺参数都会对修饰产生极大影响。为了生产一致性产品，保证这些修饰在每一轮抗体合成中的一致性至关重要。修饰分析包括二硫键桥作图和对聚糖基本结构的评估。由于唾液酸可能会对mAb产生不利影响，因此最好对唾液酸化修饰进行量化。

单抗电荷分布

翻译后修饰(PTM)和化学修饰会产生电荷异构体，严重影响单抗的生物活性和药代动力学。电荷异构体分析属于单抗制剂的监管要求，可采用阳离子交换色谱(CEX)和毛细管等电聚焦(cIEF)等技术。

单抗物理检定和大小分布

单抗物理检定

物理检定用于单抗的外观表征，比如pH、渗透压浓度摩尔和浓度的测量。还可采用卡尔费休湿度分析或染料浸入等物理检定方案来确认包装的密封完整性。

单抗大小分布

虽然预期的是单一的单抗产品，但初步得到的生产材料中通常含有各种大小的变异体，比如聚集体、肽段以及具有额外轻链的生物分子。这些物质可能会影响免疫原性和效能，因此必须进行监测。体积排阻色谱(SEC)是评估大小分布的最常用方法。 

无菌性&杂质

宿主细胞蛋白杂质

生物疗法中ppm水平的宿主细胞蛋白(HCP)杂质会引起患者体内无法预测的免疫反应，是主要的免疫原性风险。这些杂质复杂多样，因而难以进行检测或监测。尽管在典型的下游纯化过程中，大多数宿主细胞蛋白(HCP)杂质均被有效去除，但剩余的一小部分HCP特别具有挑战性。敲除一种难以清除的CHO宿主细胞蛋白——脂蛋白脂肪酶，用于改善单克隆抗体制剂中的聚山梨酯稳定性。

生产添加剂监测

在单抗开发和生产中，必须对各种生产添加剂进行监测，包括去污剂、蛋白质A、转染试剂、抗生素、消泡剂和生长因子。

单抗微生物检测

各种微生物检测程序是GMP和合规药物开发和生产的必备检测。微生物生长快、产量高，会产生许多mAb，因此监测和控制微生物污染物至关重要。革兰氏阴性菌细胞壁的一种成分（即所谓的内毒素）可引起从发烧、发冷到致命感染性休克等一系列反应，因此热原检测（MAT体外检测）以及随后的单克隆抗体热原去除均至关重要，属于监管强制性规定。微生物负荷检测应贯穿整个单抗生产过程，以监测潜在的有害微生物污染。无菌检测同样十分重要，以确证单抗生产的完整性。