ALiCE^®无细胞蛋白质合成系统的实验方案

• ALiCE^®无细胞蛋白质表达系统简介
• ALiCE^®无细胞蛋白质表达试剂盒内容物
• 其他产品信息
• ALiCE^®无细胞蛋白质表达实验方案
  • ALiCE^®表达载体
  • 通过pALiCE载体克隆制备模板
  • 其他方法
  • DNA纯化
  • 转录/翻译偶联反应设置
  • 反应建立和反应
  • 微粒体产出蛋白回收
  • 产出蛋白检测
  • 产出蛋白分离
• 疑难解答
• 参考文献
• 附录A：pALiCE质粒序列信息

ALiCE^®无细胞蛋白质表达系统简介

源自细胞粗提物的无细胞蛋白合成(CFPS)或蛋白表达(CFPE)系统已被用作研究工具数十年，并为蛋白表达技术带来了许多有吸引力的优势。然而，作为细胞表达的替代方法，CFPE系统应用的关键障碍是蛋白产量相对较低的问题。

为了解决这个问题，我们利用植物细胞生物学的优势创建了一种新型的真核无细胞表达系统，以批量模式提供了高达3mg/mL的空前的蛋白产量。ALiCE^®无细胞蛋白表达系统能够克服活宿主系统的局限性，并在数小时而不是数周内获得“难以生产”的蛋白质。

ALiCE^®系统采用的是去除液泡的烟草细胞裂解物，包含体外转录（RNA聚合酶，NTP）和翻译反应（核糖体，翻译起始/延伸因子，tRNA等）所需的全部因子，通过简单的方案在同一个试管中进行RNA转录和翻译的偶联反应。

只需将质粒DNA加入ALiCE^®反应混合物即可轻松开始反应。ALiCE^®出色的蛋白产率源于在反应过程中始终保持高效的蛋白表达。因此，我们建议将反应持续时间设为48小时。

ALiCE^®系统提供了pALiCE01和pALiCE02两种表达载体，可根据目标蛋白的靶向定位而选用。专门用于配合ALiCE^®表达系统提供出色的蛋白产量。pALiCE01用于在ALiCE^®胞质部分表达。pALiCE02靶向微粒体，可表达翻译后修饰（如二硫键）蛋白。

ALiCE^®系统主要用于蛋白质筛选，还可用于大规模表达目标蛋白。ALiCE^®系统的其他潜在应用包括：

• 靶蛋白表征
• 蛋白质优化
• 突变体筛选
• 蛋白质相互作用
• 表达分析
• 蛋白质定位分析
• 蛋白结晶和结构分析
• 翻译后修饰分析
• 代谢组学
• 除草剂筛选

ALiCE^®无细胞蛋白质表达试剂盒内容物

用户自备材料：

• 手套
• 移液枪吸头（无RNA酶）
• 无RNA酶水（例如，密理博过滤器产水）
• 水平摇床
  • 在管中进行反应：
    台式摇床（2 mL容器架），振幅：3 mm OR
  • 在微孔板中进行反应：
    振荡时控制湿度（最高70%），振幅：25 mm，带板架和96孔半量微孔板（无RNA酶）

其他产品信息

注意事项

• RNA酶污染会导致蛋白质减产或无产，仅使用无RNA酶吸头并全程穿戴手套。
• ALiCE^®试剂盒在反应全程都需要氧气，切勿密封反应容器。

运输和储存ALiCE^®试剂盒以干冰运输。收到后，应立即按上表所示温度储存各组分。对应温度下的反应混合物可稳定保存长达12个月。

产品使用限制 ALiCE^®试剂盒仅供研究使用。不可用于疾病的诊断、预防或治疗，也不可用于人类服用。参见有限使用标签许可证书(LULL)。

产品担保ALiCE^®试剂盒以干冰冷冻运输。收货时如包装中的干冰耗光或包装损坏，试剂盒的质量可能受损。收货时如发现任何问题，请立即联系我们。在产品标示有效期之前，质保都会有效。

质量保证 ALiCE^®试剂盒组分采用高品质化学品和材料生产。每一批次均经过认真检验，确保所有组分符合标准要求（参见CoA质检证书）。

安全性 用户应查看所有处理使用化学品和重组DNA的适用法规。使用试剂盒组分时应穿戴实验服、护目镜和手套。使用超冷材料时，需额外穿戴防护手套防止冻伤。用过的组分需按照当地法规处置。

免责声明对于ALiCE^®使用、误用或使用结果造成的任何直接或间接损伤或损失，我们不承担任何责任。 

ALiCE^®无细胞蛋白质表达实验方案

ALiCE^®蛋白质表达系统每次使用都依循简单的流程：

ALiCE^®表达载体

ALiCE^®试剂盒提供两种载体，满足不同蛋白表达需要：

1. pALiCE01，用于表达易于生产的蛋白。这种质粒表达的蛋白靶向细胞质部分，适合高产应用。这种表达载体不能引导翻译后修饰。

2. pALiCE02，用于表达难以生产的蛋白，如二硫键蛋白。微粒体是制造ALiCE^®反应混合物时由内质网碎片形成的细胞器样结构。使用蜂毒溶血肽(melittin)的信号肽，可将蛋白质转位至这类细胞器中(Buntru et al., 2015)，进行翻译后修饰。之后破碎微粒体，可回收表达蛋白（见说明书第10页）。

pALiCE01和pALiCE02也可用作蛋白表达的阳性对照，加入ALiCE^®反应混合物后分别在细胞质和微粒体表达eYFP（增强型黄绿色荧光蛋白）。使用pALiCE01作为阳性对照时，反应混合物在48小时后呈现黄色。

通过pALiCE载体克隆制备模板

下图为pALiCE01和pALiCE02质粒载体的图谱信息（图1），以及目的基因5’和 3’方向克隆位点的放大视图（图2和图3）。质粒序列见附录A。

在T7启动子和5’非翻译区(UTR)后的克隆位点可用于插入目的基因。要克隆目的基因，可从现有载体上亚克隆或通过PCR扩增其编码区，以备引入适当的限制酶切位点。推荐用于细胞质表达质粒pALiCE01的限制位点是Nco I和Kpn I，微粒体表达质粒是Nco I/Not I或Nco I/Kpn I。如使用Kpn I进行克隆，务必保证开放阅读框包含终止密码子。

通过标准克隆技术插入目的基因后(Green & Sambrook, 2012)，将质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞。如使用其他大肠杆菌菌株，由于会造成质粒品质下降，可能会影响目标蛋白产量。载体编码β-内酰胺酶，用于在含氨苄青霉素的培养基上进行筛选。

注意：使用其他基于T7的真核载体会降低蛋白产量，而原核载体不适用于ALiCE^®试剂盒。

其他方法

建议在使用ALiCE^®试剂盒时，通过标准克隆方法扩增质粒及其中的目的基因。不过，为了避免将质粒引入任意细胞从而节约时间和人力，目前已有多种无细胞系统方法，包括滚环扩增法（Wang et al., 2016和Kumar & Chernaya, 2009）。使用ALiCE^®试剂盒时，也可由第三方合成含有目的基因的质粒，再直接施用于裂解物，这种方法尚未验证过是否能获得高产。

DNA纯化

为了促进高效的转录-翻译反应，需要制备超纯的质粒DNA。强烈建议采用以阴离子交换色谱为基础的方法制备质粒（例如，Macherey-Nagel公司的NucleoBond® Xtra Midi质粒中提试剂盒）。对于基于硅胶基质的质粒DNA制备试剂盒，建议在开始转录-翻译反应前，添加RNA酶抑制剂或进行酚-氯仿沉淀。

添加适量的5 mM Tris缓冲液(pH 8.5)将质粒DNA调至需要的浓度，浓度视插入基因的大小而定。在反应混合物中的终浓度应为5 nM。-20°C分装储存。

转录/翻译偶联反应设置

转录-翻译偶联反应的体积一般设为50 µL。

1.选择反应容器
•ALiCE^®管 = 52 µL/反应
•96孔半量微孔板，带盖¹ = 50 µL/反应

2.准备DNA 取出保存的DNA模板，室温(20 - 25 °C)解冻。轻弹混合并短暂离心收集管底沉淀，置于冰上暂存。稀释或浓缩质粒，使其在配好的反应液中的终浓度为5 nM。DNA浓度对蛋白产量影响很大。

3.解冻ALiCE^®反应混合物1 取出保存的DNA模板，室温(20 - 25 °C)解冻。轻弹混合并短暂离心收集管底沉淀，置于冰上暂存。稀释或浓缩质粒，使其在配好的反应液中的终浓度为5 nM。DNA浓度对蛋白产量影响很大。

¹ 为了取得最佳结果，建议使用greiner bio-one微孔板，货号675086。

反应建立和反应

ALiCE^®管

ALiCE^®管 按下表在ALiCE^®管中建立反应：

• 仅使用试剂盒提供的穿孔帽盖住ALiCE^®管。
• 在台式水平摇床中按700 rpm、25 °C、48小时孵育ALiCE^®管。为了获得最佳结果，建议振幅设为3 mm，并使用2 mL容器架。

注意：整个反应过程都需要持续的氧气供应。因此，管中的反应体积最多能提高到200 µL，并且仍有可能影响产率。超过200 µL的反应体积建议将样品分成更小份。

96孔半量微孔板
按下表在微孔板中配制试剂：

• 在微孔板反应区之间的空隙中加水（每个75 µL），以便在孵育时维持板中的高湿度。
• 在水平摇床中按500 rpm、25 °C、48小时孵育微孔板。为了获得最佳结果，建议振幅设为12.5 mm或25 mm，并控制湿度> 70 %。若无法进行湿度控制，建议在摇床中放置装水的开放容器，营造高于环境的相对湿度。

注意：在70%以下湿度时，蛋白仍有可能表达，但试剂会蒸发，表达产量可能减少。切勿密封反应容器或微孔板。

DNA模板浓度的注意事项
如不计算待使用的DNA模板浓度(5 nM)，可通过下式近似估计需要的模板质量：

回收微粒体产出蛋白

使用ALiCE^®试剂盒搭配pALiCE02载体表达蛋白时，目标蛋白会出现在反应混合物的微粒体中。按下列步骤释放微粒体中的目标蛋白：

1. 在ALiCE^®反应体系中加入0.5% n-十二烷基-β-麦芽糖苷(DDM)，裂解含合成蛋白的微粒体。
2. 室温下700 rpm振荡孵育10 min。不可涡旋。
3. 按16,000 x g、10 min室温离心裂解反应液。将含有合成蛋白的上清转移至新的反应管。
4. 注意上清中的DDM可能会影响后续操作，例如，活性检测或色谱纯化。

合成蛋白检测

合成的目标蛋白可通过SDS-PAGE电泳检测，电泳要求高分辨率和恰当的凝胶浓度，以确保表达蛋白与背景蛋白清楚分离。建议使用SDS-PAGE梯度胶，且最大上样量不超过1 µL。另建议进行变性SDS- PAGE时，对样品进行99 °C、10 min的热处理。

产出蛋白分离

ALiCE^®系统合成的重组蛋白可通过传统的色谱分离方法纯化，例如，亲和标签纯化。

附录A：pALiCE质粒序列信息

pALiCE01：

序列

TAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAAC ATTACATTTTACATTCTACAACTACCATGGCTTGGTCTCATCCGCAATTCGAAAAAAGCGCTGAAAAC CTGATCGAAGGCCGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAG CTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTAC GGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGA CCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTT CAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTAC AAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATC GACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCT ATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGA CGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCT GCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCAC ATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAT AAGGTACCAAGCTCTTCTGGTTTGGTTTGGACCTCTGGTCCTGCAACTTGAGGTAGTCAAGATGCATA ATAAATAACGGATTGTGTCCGTAATCACACGTGGTGCGTACGATAACGCATAGTGTTTTTCCCTCCAC TTAAATCGAAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGCGGGTCAAATGTATATGGTTCATATACATCCGCAGGCA CGTAATAAAGCGAGGGGTTCGAATCCCCCCGTTACCCCCGGTAGGGGCCCATTATAGCCGAATTCGG CGCGCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATT CAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGT ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTC ACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGA ACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCA CTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGC CGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGG CATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTC TGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCG CCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCT GTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACA ATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGC TGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGTTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGC CAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACG AAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACT CATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGA TAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGA TCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGC TACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGC AGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGT AGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGT GTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGG GTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCT ATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGG AACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTT CGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACG CCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG

pALiCE02：

序列

TAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAAC ATTACATTTTACATTCTACAACTACCATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATA CATTTCTTACATCTATGCGGCTGCCATGGCTTGGTCTCATCCGCAATTCGAAAAAAGCGCTGAAAACC TGATCGAAGGCCGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGC TGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACG GCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGAC CACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTC AAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACA AGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCG ACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTA TATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGAC GGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTG CCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACA TGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCGGC CGCTCTCGAGCCCGGGGGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATTAGTAATAAGGATCCTCTAGAGGTA CCAAGCTCTTCTGGTTTGGTTTGGACCTCTGGTCCTGCAACTTGAGGTAGTCAAGATGCATAATAAAT AACGGATTGTGTCCGTAATCACACGTGGTGCGTACGATAACGCATAGTGTTTTTCCCTCCACTTAAAT CGAAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGCGGGTCAAATGTATATGGTTCATATACATCCGCAGGCACGTAAT AAAGCGAGGGGTTCGAATCCCCCCGTTACCCCCGGTAGGGGCCCATTATAGCCGAATTCGGCGCGCC AGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATAT GTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTA TTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGA AACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGAT CTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAA AGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATA CACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGAC AGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAA CGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGA TCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCA ATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAAT AGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTT ATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGTTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATG GTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAG ACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATA TACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCT CATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAG GATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAG CGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCG CAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACC GCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTA CCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGT GCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGA AAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAG GAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCA CCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGC AACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATG

ALiCE是德国LenioBio GmbH公司所有的注册商标名。NucleoBond是Macherey-Nagel所有的注册商标名。有限使用标签许可证书 仅供研究使用