聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种基础技术，基于电泳迁移率分离蛋白质和其他大分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺交联分子聚合而成。丙烯酰胺和双丙烯酰胺共同形成孔隙，而蛋白质可以通过这些孔隙迁移。
聚丙烯酰胺凝胶由两部分组成：浓缩胶和分离胶。浓缩胶部分含有低百分比的丙烯酰胺，用于将样品浓缩成单一条带，然后进入分离胶。分离胶含有高百分比的丙烯酰胺，可按大小分离蛋白质。丙烯酰胺浓度与孔隙尺寸线性相关；丙烯酰胺浓度越高，凝胶内的孔隙就越小。小孔隙适合分离低分子量蛋白质。
聚丙烯酰胺凝胶
PAGE使用不连续缓冲体系，其中的凝胶缓冲离子与电泳缓冲离子不同。这两种离子电泳迁移率的差异，导致蛋白质通过时形成动态电压梯度。Tris-Glycine凝胶是最常用的PAGE系统，采用由Tris-HCl组成的凝胶以及由Tris碱和甘氨酸组成的电泳缓冲液。Tris-Glycine凝胶在高碱性环境下工作，可能引起非必要的蛋白质变性，如脱氨和烷基化。因此，在Tris-Glycine凝胶中，蛋白质条带可能会扭曲或分辨率下降。
而Bis-Tris凝胶的凝胶缓冲液使用Bis-Tris和HCl，电泳缓冲液使用MOPS或MES。Bis-Tris凝胶在中性pH下工作，可最大限度减少蛋白质改性，提升凝胶电泳期间的蛋白质稳定性。这也进一步提升了蛋白质条带的分离度和准确度。Bis-Tris凝胶的保质期也比Tris-Glycine凝胶更长——后者会随时间推移开始水解。Bis-Tris凝胶可与MOPS或MES电泳缓冲液灵活搭配；两种离子的迁移率差异导致分离的蛋白质范围不同。MES适合分离小分子蛋白(<50 kDa)，而MOPS适合分离中大分子蛋白质。
在蛋白质制备过程中，考虑样品缓冲液的类型也很重要。在Tris-Glycine凝胶中，Laemmli缓冲液通常用于在带负电荷的SDS离子中进行蛋白质变性和包埋。接着将样品在100℃下煮沸，以促进其变性。加热Laemmli缓冲液至100 °C会使pH变为强酸性，这种热和酸性的结合经证可能导致Asp-Pro肽键上的蛋白质优先裂解（Rittenhouse和Marcus, 1984）。这在电泳过程中会产生明显的蛋白质降解产物。而Bis-Tris凝胶使用LDS样品缓冲液，在样品制备过程中保持碱性pH，不需要加热到70℃以上就能使蛋白质完全变性。该制剂可最大限度避免切割Asp-Pro肽键，维持蛋白质的完整性。
| Tris-Glycine | Bis-Tris | |
|---|---|---|
| 工作pH | 9.5（碱性） | 7.0（中性） |
| 样品缓冲液pH | 5.2 | 8.5 |
| 离子运行方向 | Tris (+) Glycine (-) | Tris (+) MOPS (-) MES (-) |
| 分离的蛋白质范围 | 6 kDa – 400 kDa | 6 kDa – 400 kDa |
| 分离期间的蛋白质稳定性 | 可能发生脱氨和烷基化 | +++ |
| 对Asp-Pro肽键的作用 | 长时间加热SDS样品缓冲液导致裂解 | LDS样品缓冲液使用温和加热条件，Asp-Pro键保持完整 |
| 运行时间 | 中等 | 快速 |
| 保质期 | 有限 | 4周以上 |
图 1.Tris-Glycine（左侧）和Bis-Tris（右侧）凝胶的对比。手动灌制12%浓度的Tris-Glycine和Bis-Tris丙烯酰胺凝胶，隔夜聚合。凝胶加入相同的大肠杆菌裂解产物滴定液（泳道3-6）、mPAGE®未染色蛋白质标准品（泳道2和7）以及mPAGE®彩色蛋白质标准品（泳道1）。分别在Tris-Glycine或MOPS电泳缓冲液中跑胶，用ReadyBlue™蛋白凝胶染色1小时，用去离子水脱色1小时。
手动灌注聚丙烯酰胺凝胶
尽管市面上可以购买到专用的预制聚丙烯酰胺凝胶（例如可分析不同大小蛋白质的在丙烯酰胺梯度凝胶），但许多研究人员仍可能选择手动灌制聚丙烯酰胺凝胶。手动灌制聚丙烯酰胺凝胶比预制胶便宜；但试剂和灌注设备的准备工作繁琐而耗时。凝胶缓冲液制备过程中的人为差异也会导致凝胶性能和质量参差不齐。
mPAGE® TurboMix Bis-Tris制胶试剂盒
mPAGE® TurboMix Bis-Tris制胶试剂盒提供了预混缓冲液和丙烯酰胺溶液，根除了手动灌注凝胶人为差异和耗时的顽疾。试剂盒包括20%丙烯酰胺分离胶溶液，可配制丙烯酰胺凝胶的分离胶部分。分离溶液可以用去离子水稀释至所需的丙烯酰胺百分比，范围为8% - 15%。试剂盒包括4%丙烯酰胺浓缩胶溶液，用于形成丙烯酰胺凝胶的浓缩胶部分。这些预配溶液支持快速灌注，在灌注分离胶和浓缩胶之间无需等待聚合。以下是演示视频和简单方案。
演示视频：使用mPAGE® TurboMix Bis-Tris试剂灌制聚丙烯酰胺凝胶
mPAGE® TurboMix快速制胶实验方案
- 将mPAGE® TurboMix分离胶溶液、去离子水、10%过硫酸铵(APS)和TEMED加入洁净的玻璃烧杯或锥形管中，制备所需丙烯酰胺比例的分离胶。表2-4中的体积可倍增，一次灌注多支凝胶。备注：临灌注前添加10% APS和TEMED。
| （1 mm厚度微型胶） | |||||
| 分离胶 | 浓缩胶 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 凝胶比例 | 8% | 10% | 12% | 15% | 4% |
| mPAGE® TurboMix分离胶溶液 | 2.4 mL | 3.0 mL | 3.6 mL | 4.5 mL | n/a |
| mPAGE® TurboMix浓缩胶溶液 | n/a | n/a | n/a | n/a | 2 mL |
| 去离子水 | 3.6 mL | 3.0 mL | 2.4 mL | 1.5 mL | n/a |
| 10% APS | 30 µL | 30 µL | 30 µL | 30 µL | 20 µL |
| TEMED | 3 µL | 3 µL | 3 µL | 3 µL | 2 µL |
| （0.75 mm厚度微型胶） | |||||
| 分离胶 | 浓缩胶 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 凝胶比例 | 8% | 10% | 12% | 15% | 4% |
| mPAGE® TurboMix分离胶溶液 | 1.8 mL | 2.25 mL | 2.7 mL | 3.38 mL | n/a |
| mPAGE® TurboMix浓缩胶溶液 | n/a | n/a | n/a | n/a | 1.5 mL |
| 去离子水 | 2.7 mL | 2.25 mL | 1.8 mL | 1.12 mL | n/a |
| 10% APS | 22.5 µL | 22.5 µL | 22.5 µL | 22.5 µL | 15 µL |
| TEMED | 2.25 µL | 2.25 µL | 2.25 µL | 2.25 µL | 1.5 µL |
| （1.5 mm厚度微型胶） | |||||
| 分离胶 | 浓缩胶 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 凝胶比例 | 8% | 10% | 12% | 15% | 4% |
| mPAGE® TurboMix分离胶溶液 | 3.6 mL | 4.5 mL | 5.4 mL | 6.75 mL | n/a |
| mPAGE® TurboMix浓缩胶溶液 | n/a | n/a | n/a | n/a | 3.0 mL |
| 去离子水 | 5.4 mL | 4.5 mL | 3.6 mL | 2.25 mL | n/a |
| 10% APS | 45 µL | 45 µL | 45 µL | 45 µL | 30 µL |
| TEMED | 4.5 µL | 4.5 µL | 4.5 µL | 4.5 µL | 2 µL |
- 将mPAGE® TurboMix浓缩胶溶液加入洁净的玻璃烧杯或锥形管中，制备浓缩胶胶，然后添加所需数量的TEMED和10% APS。备注：临灌注前添加10% APS和TEMED。
- 轻柔混匀试剂，避免将气泡带入凝胶混合物中。
- 使用血清学移液管，向各胶盒中灌注分离胶至所需高度。
- 将血清学移液管放在胶盒中间，轻柔加入浓缩胶，填充到短玻璃板顶端。加样处可能出现液位下降，但会趋于平衡。
- 小心快速插入胶梳，避免气泡滞留在梳齿间。
- 等待凝胶聚合1小时。
- 凝胶可立即使用，也可以包在去离子水浸泡过的纸巾中，放在4 °C密闭容器中最多储存4周。
制备样品并跑胶
- Bis-Tris凝胶需要LDS上样缓冲液，其碱性高于SDS样品缓冲液。样品可以用DTT或β-巯基乙醇还原，也可以不还原——具体取决于应用。依据表5制备样品。
| 还原 | 未还原 | |
|---|---|---|
| 样品 | 6.5 - X µL | 7.5 - X µL |
| 去离子水 | X µL | X µL |
| 4X LDS缓冲液 4X LDS缓冲液 | 2.5 µL | 2.5 µL |
| 1 M DTT | 1 µL | N/A |
| 总体积 | 10 µL | 10 µL |
- 在70 °C下加热样品10分钟（不能沸腾）。
- 将样品和蛋白质标准品加入孔中。
- 在空孔中加入等量的1X上样缓冲液。
- 可在200 V电压下跑胶，直到染料或蛋白质标准品到达凝胶末端——大约30-60分钟，具体取决于凝胶百分比。
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