胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）的酶学测定方案

• 注意事项
• 所需试剂和设备
• 制备说明
• 操作流程
• 结果

本方案适用于使用N_α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯（BAEE）作为底物测定胰蛋白酶活性。本方案是基于以下反应的连续分光光度速率测定（A₂₅₃，光程= 1 cm）方案：

式中：
BAEE = N_α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯

单位定义：一BAEE单位的胰蛋白酶活性将产生每分钟0.001的ΔA₂₅₃，BAEE为底物，pH值为7.6，温度为25℃，反应体积为3.20 ml。

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书，获取危害和安全操作方法相关信息。

所需试剂和设备

磷酸钠，一元（货号：S0751）

N_α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯（BAEE，货号：B4500）

1 M NaOH溶液

1 M盐酸（货号：318949）

制备说明

使用超纯水（25°C时 ≥ 18 MΩ×cm）制备试剂。

缓冲液（67 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.6，25℃） – 在超纯水中使用磷酸钠，一元（货号：S0751）制备8.04 mg/ml溶液。在25 ℃下用1 M NaOH溶液将pH调节至7.6。

底物溶液（0.25 mM N_α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯） – 在缓冲液中使用N_α苯甲酰基-L-精氨酸乙酯（BAEE，货号：B4500）制备0.086 mg/ml溶液。

HCl溶液（1 mM盐酸） – 在超纯水中制备1 M盐酸溶液（货号：318949）的1,000倍稀释溶液。

酶溶液（胰蛋白酶） – 在使用前，立即在冷的（2-8℃）HCl溶液中制备含有425-575单位/ml胰蛋白酶的溶液。

操作流程

在3.20 ml反应混合物中，最终浓度为62.8 mM磷酸钠，0.23 mM N_α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯，0.031‑0.063 mM盐酸，和42.5‑115.0单位胰蛋白酶。

1.移取以下试剂到合适的石英比色皿中：

注意：一式三份执行测试。

2.倒置混合，并在适当恒温的分光光度计中平衡至25℃。然后添加：

注意：每个比色皿中的最终体积必须为每定义单位3.2 ml。

3.立即通过倒置混合，并记录5分钟内的A₂₅₃增量。使用1分钟时间段和至少4个数据点，使用空白和测试的最大线性速率获得ΔA₂₅₃/min。

结果

计算

1.

式中：
df = 稀释因子
0.001 = 基于单位定义的A₂₅₃/min变化
0.075 = 测定中使用的试样体积（ml）
注意：由于单位定义是基于3.2 ml，因此计算中不使用比色皿中的总体积。

2.