β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)的酶促检测

1.目标

标准化β-淀粉酶活性测定的操作步骤。

2.适用范围

该操作步骤适用于可检测β-淀粉酶活性的所有产品。

3.定义

3.1纯水 – 来自去离子系统的水，电阻率>或= 18MΩ•cm @ 25 ºC

3.2.单位定义 – 在pH 4.8、温度20 °C条件下，一个单位可在3分钟内从淀粉中释放出1.0 mg麦芽糖。

3.3.STD = 麦芽糖标准品

4.讨论

淀粉+ H₂O    ^β-淀粉酶   >还原基团（麦芽糖）

5.责任

应由经过培训的分析服务实验室人员负责按照书面规定执行此程序。

6.安全

有关危险和适当的操作注意事项，请参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1 条件：
温度 = 20°C，pH = 4.8，A_540nm，光程 = 1 cm

7.2 方法：
光谱法终止反应

7.3 试剂：

7.3.1    16 mM乙酸钠缓冲液，在20 °C条件下的pH值为4.8 以纯水为溶剂，使用醋酸钠三水合物（S8625）制备100 mL缓冲液。在20 °C下，使用1 M HCl调整pH至4.8。

7.3.2.    1.0% (w/v)可溶性淀粉溶液（淀粉） 以试剂A为溶剂，使用马铃薯可溶性淀粉（S2630）制备25 mL溶液。通过直接在加热/搅拌板上连续搅拌来加热玻璃烧杯中的淀粉溶液，以促进溶解。煮沸并使溶液在该温度下维持15分钟。通过搅拌使淀粉溶液冷却至室温。通过加入纯水使淀粉溶液恢复至原始体积（25 mL），然后一边搅拌一边分装，以供测定使用。

7.3.3.    酒石酸钾钠溶液 将12.0克酒石酸钾钠四水合物（S2377）溶于预热至50 °C - 70 °C的8.0 mL 2 M NaOH中。通过直接在加热/搅拌板上连续搅拌加热，使其溶解。请勿煮沸。

7.3.4.    96 mM 3,5-二硝基水杨酸溶液 以预热至50 °C - 70 °C的纯水为溶剂，使用3,5-二硝基水杨酸（D0550）制备20 mL溶液。通过直接在加热/搅拌板上连续搅拌加热，使其溶解。请勿煮沸。

7.3.5.    显色试剂溶液(Clr Rgt Soln) 向温度为50 °C - 70 °C的12 mL纯水中缓慢加入试剂7.3.3，然后加入试剂7.3.4。终体积为40 mL。如果未完全溶解，则应在混合时溶解。溶液应装在琥珀色瓶中并存放在室温下。显色试剂溶液可稳定保存6个月。

7.3.6.    0.2% (w/v) (STD) 以纯水为溶剂使用麦芽糖一水合物（M5885）制备10 mL溶液。

7.3.7    β-淀粉酶溶液（酶）

7.3.7.1    现配现用，使用20 °C的纯水制备含1单位/mL β-淀粉酶的溶液。

7.3.7.2    如果检测酶需要需要稀释，则第一次及随后的稀释均应该使用20 °C纯水，直至最后一次稀释，并且最后一次应稀释在20 °C纯水中。

7.4 检测

7.4.1 将下列试剂移液（毫升级）至合适的容器中：

7.4.2    涡旋混合并平衡至20 °C。然后加入：

7.4.3    涡旋混合并在20 °C孵育3.0分钟。然后加入：

7.4.4    盖上透气盖并放在沸水浴中。然后加入：

7.4.5    煮沸15分钟，然后在冰上冷却至室温，冷却时间约为3分钟，然后加入：

7.4.6

7.4.7 颠倒混匀，使用合适的分光光度计检测和记录测试样品和空白样品的A_540nm。

7.4.8    由于3分钟的酶催化孵育时间较短，因此每个测试批次必须一次运行一个。

7.5.标准曲线：

7.5.1    将下列试剂移液（毫升级）至合适的容器中，绘制标准曲线：

7.5.2    将样品置于沸水浴中煮沸15分钟，然后在冰上冷却至室温，并加入：

7.5.3    颠倒混匀，使用合适的分光光度计检测和记录标准品和空白标准品的A_540nm。

7.6 计算

7.6.1   标准曲线

ΔA_540nm 标准品= A_540nm Std - A_540nm Std空白

绘制ΔA_540nm标准品与麦芽糖重量（毫克）的关系图。计算并记录斜率、y轴截距和线性回归(r2).

7.6.2    样品测定

ΔA_540nm 样品= A_540nm 测试样品- A_540nm 空白样品

使用标准曲线确定麦芽糖释放量（毫克）。

    df =稀释系数
    1 = 酶使用体积(ml)

7.7    最终检测度
在2.00 mL反应混合物中，终浓度为8 mM乙酸钠、0.50% (w/v)淀粉和1单位β-淀粉酶。

8.参考文献

Bernfeld, P. (1955) Methods in Enzymology 1, 149-158