二乙醇胺测定法用于碱性磷酸酶的酶法测定（EC 3.1.3.1）

1.目标

为了标准化碱性磷酸酶、二乙醇胺的酶促测定程序。

2.适用范围

2.1 本程序适用于所有对使用二乙醇胺测定系统的碱性磷酸酶有规格要求的产品。

2.2 本酶法不应用于测定仅在甘氨酸单位引用比活性的碱性磷酸酶。

3.定义

3.1 纯化水——来自去离子系统的水，电阻率 ~18MΩcm@25°C

3.2 单位定义——一个 DEA 单位可在 37 °C pH 9.8 时每分钟水解 1.0 μmole 的磷酸对硝基苯酯。

3.2 Pi——无机磷酸盐

4.讨论

磷酸对硝基苯酯 +H₂O     ^{碱性磷酸酶}   > 对硝基苯酚 + Pi

5.责任

所有经培训的分析服务人员都有责任遵循该书面实验步骤。

6.安全

有关危险和适当的操作注意事项，请参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1 条件：

T = 37 °C，pH = 9.8，A_750nm，光路 = 1 cm

7.2 方法：

连续光谱法速率测定

7.3 试剂：

7.3.1 1.0 M二乙醇胺缓冲液，含 0.50 mM 氯化镁，pH 9.8，37 °C（缓冲液）
用二乙醇胺，如产品编号D8885，在纯化水中配制140 mg/mL的溶液。用5M HCl在37 ℃调节二乙醇胺的pH值至 9.8。用纯化水将pH调节溶液稀释至105 mg/mL二乙醇胺终浓度，并加入0.5 mL/L 1M氯化镁溶液，如产品编号M1028。
新鲜制备，避光。

7.3.2 0.67 M 磷酸对硝基苯酯溶液（PNPP）
用磷酸酶底物，如产品编号P4744，在纯化水中配制247 mg/mL溶液。新鲜制备，避光。

7.3.3 碱性磷酸酶溶液（酶）

7.3.3.1 临用前，在冷缓冲液中配制含有约 0.15 单位/mL 碱性磷酸酶的溶液。

7.3.3.2 对于液体样品，使用前立即在冷缓冲液中配制浓缩（2000 单位/mL 或更高）的储备溶液。进行后续稀释，使最终溶液在冷缓冲液中含有约 0.15 单位/mL。

7.4 方法：

7.4.1 将下列试剂按以下顺序（按毫升数）移液到相应的比色杯中：

7.4.2 倒置混合，平衡至 37^oC。使用恒温分光光度计监测 A405 nm 直至恒定。然后添加：

7.4.3 立即倒置混匀，记录 A405 nm 处的增加约 5 min。在一分钟的时间间隔内使用最少四个数据点，使用测试物和空白的最大线性速率获得 ΔA405 nm/分钟。

7.5 计算

7.5.4    V_F = 分析容量（毫升数）
df = 稀释因子
18.5 = 405 nm处对硝基酚的毫摩尔分子消光系数
V_E = 使用的酶体积（毫升数）

7.6 最终分析浓度
在3.00 mL反应混合物中，终浓度为983 mM二乙醇胺、0.49 mM氯化镁、11.2 mM对硝基苯磷酸酯和约0.0075 U碱性磷酸酶。

8.审批

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