人激酶慢病毒CRISPR库

Sigma CRISPR人类激酶混合慢病毒库
Sigma-Aldrich将其在汇集慢病毒筛选方面的长期专业知识与其CRISPR基因组编辑技术相结合，创建了一个强大的新发现工具：Sigma CRISPR人类激酶汇集慢病毒文库。这个汇集的文库靶向人类kinome，这是大约700个通常与发育和疾病相关的基因的集合，每个激酶基因平均有近9个独特的敲除CRISPR克隆。慢病毒形式允许稳定整合，选择和富集转导的细胞，从而使研究人员能够在功能上筛选数百种激酶基因，而筛选阵列克隆的时间和成本仅需一小部分。
Sigma CRISPR人类激酶合并慢病毒文库使用单个慢病毒载体（pLV-U6g-EPCG）将Cas9，gRNA，嘌呤霉素选择标记和GFP递送至靶细胞。该载体具有强大的截短的人类延伸因子−1启动子α（tEF1a），可驱动Cas9蛋白的表达，并具有确保gRNA在大多数哺乳动物细胞类型中有效转录的人类U6启动子。Cas9侧翼的2A肽（P2A和T2A）允许嘌呤霉素抗性基因，Cas9和GFP作为单个转录本中的单个蛋白质进行化学计量表达（请参见下面的向量图）。如果您对小分子筛选或典型的发育信号通路感兴趣，Sigma′s CRISPR人类激酶慢病毒库将为研究人员提供高通量解决方案，以发现只有敲除筛选才能揭示的新激酶靶标。

功能基因组学/筛选/靶标验证

使用Sigma CRISPR合并慢病毒敲除人类激酶
蛋白激酶是最大，研究最深入的基因家族之一。蛋白质磷酸化通过介导发育，转录，免疫反应，代谢，凋亡和细胞分化过程中的信号转导，在真核生物的细胞间通讯中起着至关重要的作用。激酶的异常调节在许多疾病中起因果作用，对这些蛋白质及其功能的研究将有助于新疗法的发现和开发。
Sigma CRISPR人激酶慢病毒合并敲除文库包含：

• 超过6,000个表达Cas9和gRNA序列的独特慢病毒克隆，旨在功能性灭活（敲除）近700个人类激酶基因
• 高克隆覆盖率（每个激酶基因7−10个不同的gRNA，每个基因平均8.6个）增加了命中分析的统计强度
• 大量内置的富集和耗竭克隆使研究人员能够自信地评估其合并筛选实验的成功
• 该库包含100个非靶向对照gRNA作为标准化标准
• gRNA设计和平铺是通过严格的生物信息学方法创建的，以最大程度地减少每个gRNA的脱−靶修饰

慢病毒人激酶库以8 x 25 μl等分试样的200 μl形式提供，最小滴度为5x10^8病毒颗粒/mL。

本产品仅供R&D使用，不得用于药物、家庭或其他用途。有关危险和安全处理方法的信息，请参阅安全数据说明书。尽管产生的慢病毒转导颗粒不能复制，但建议在实验室操作中将其视为2级风险（RGL−2）物种。遵循所有已发布的RGL−2实验室处理和废物净化指南。

Sigma慢病毒CRISPRs
基于慢病毒的颗粒允许表达盒有效地转导和整合到分化和不分裂的细胞中，例如神经元和树突状细胞。 通过与兼容的包装质粒共转染，在生产细胞（HEK 293T）中产生了自灭活复制能力不强的慢病毒颗粒。 另外，慢病毒转导颗粒用来自水泡性口炎病毒（VSV-G）的包膜G糖蛋白假型化，从而可以转导多种哺乳动物细胞。

Puro Kill曲线和每毫升CFU（菌落形成单位）的测定。
在进行文库规模的筛选之前，必须进行两个预实验：（1）确定靶细胞类型对嘌呤霉素的敏感性（杀灭曲线），和（2）通过完成集落形成测定（以CFU/mL测量）来确定慢病毒在您的细胞类型中的功能滴度。 MOI（感染多重性）的计算应基于CFU值。 不同的细胞类型的转导效率各不相同，并且不同的慢病毒构建体的行为不同，因此在进行合并实验之前，使用对照慢病毒CRISPR克隆（可从Sigma获得）优化实验条件至关重要。