人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养实验方案

HUVEC细胞储存
培养物制备
培养HUVEC
传代培养HUVEC
材料

HUVEC细胞储存

A. 冷冻保存的小管（200-05n、200p-05n、S200-05n）

冷冻管在抵达后须立即储存在液氮储存箱中。

*从液氮储罐中取出冻存管时，请务必戴上面罩和手套。从液氮储存箱到房间的剧烈温度变化可以导致冷冻管中存留的任何液氮爆裂并造成人员受伤。

培养物制备 

1. 确保具有HEPA过滤层流的II级生物安全柜处于正常工作状态。
2. 用70％酒精对生物安全柜消毒。
3. 在开始细胞培养工作之前，打开生物安全柜风机10分钟。
4. 确保所有血清移液器、移液器吸头和试剂溶液都是无菌的。
5. 遵循标准灭菌技术和安全规则：
   a.    请勿用嘴吸移液。
   b.    在处理人体细胞时，请始终戴上手套和护目镜，即使所有菌株都已
         检测HIV、乙型肝炎和丙型肝炎为阴性，亦应有适当保护。
   c.    在无菌罩中进行所有细胞培养工作。

培养HUVEC

A. 准备用于培养HUVEC的细胞培养瓶

1. 从冰箱中取出内皮细胞生长培养基（211-500）。在无菌超净台中用70％酒精给瓶子消毒。
2. 吸取20 mL内皮细胞生长培养基(211-500)，*置于T-75培养瓶(SIAL0641)中。
   * 保持培养基与表面积之比为每5 cm² 1ml。
   例如：
   - 对T-25培养瓶（SIAL0639）或60 mm组织培养皿（SIAL0166）为5 mL。
   - 对T-75培养瓶（SIAL0641）或100 mm组织培养皿（SIAL0167）为15 mL。

B. 解冻和接种HUVEC

1. 在眼睛和手都有适当保护的情况下，从液氮储存箱取出冷冻保存的HUVEC小管。
2. 将瓶盖转动四分之一圈，以释放可能被困在螺纹中的液氮，然后重新拧紧瓶盖。
3. 将小管的下半部分放在37°C水浴中快速解冻细胞，并在解冻过程中密切观察小管。
4. 当小管中仅有少量冰时，从水浴中取出小管。请勿让细胞完全解冻。
5. 在无菌生物安全柜中用70％酒精对小管外部消毒。
6. 小心取下小管盖。请勿用手触摸盖子或小管的边缘，以免污染。
7. 用2 mL移液管轻轻吹5次，将细胞重悬于小管中。小心不要过于剧烈地移液以免起泡。
8. 将细胞悬浮液（1 ml）从小管移液到含有20 ml内皮细胞生长培养基（211-500）的T-75培养瓶（SIAL0641）中。
9. 盖上培养瓶并轻轻摇动，使细胞均匀分布。
10. 将T-75培养瓶（SIAL0641）置于37 ^oC、5% CO₂ 加湿培养箱中。松开盖子以便换气。为获得最佳结果，接种后24小时之内不要扰动培养物。
11. 24小时或过夜后，更换为新鲜的内皮细胞生长培养基（211-500），以除去所有痕量DMSO。
12. 每隔一天更换内皮细胞生长培养基（211-500），直至细胞达到60％融合。
13. 当培养物> 60％融合或周末培养时，将内皮细胞生长培养基（211-500）体积加倍。
14. 当HUVEC培养物达到80％汇合时，将细胞传代培养。

传代培养HUVEC

A. 制备传代培养试剂

1. 从-20°C冰箱中取出胰蛋白酶-EDTA溶液（T3924）和胰蛋白酶抑制剂（T6414），并在冰箱中解冻一夜。
2. 确保解冻所有传代培养试剂。轻轻旋转每个瓶子几次，形成均匀的溶液。
3. 将所有传代培养试剂储存在4°C以备将来使用。
4. 等分胰蛋白酶 / EDTA溶液（T3924），如果只需要一部分胰蛋白酶 / EDTA（T3924），则将未使用的部分保存在-20°C。

B. 准备培养瓶

1. 从冰箱中取出内皮细胞生长培养基（211-500）。在无菌超净台中用70％酒精给瓶子消毒。
2. 将30 mL内皮细胞生长培养基（211-500）移液至T-175培养瓶（SIAL1080）（将用于第IV C部分的步骤15）。

C. 传代培养HUVEC

在室温下对细胞进行胰蛋白酶消化。请勿将任何试剂加热至37°C。

1. 从培养瓶吸取培养基。
2. 用HBSS（H6648）洗涤单层细胞，吸除溶液。
3. 取5 mL胰蛋白酶/EDTA溶液(T3924)置于T-75培养瓶(SIAL0641)中。轻轻摇动培养瓶以确保溶液覆盖所有细胞。
4. 立即取出4.5 ml溶液。
5. 重新盖紧培养瓶盖子，并在倒置显微镜下在室温下监测胰蛋白酶消化过程。细胞通常需要约1分钟才能变圆。
6. 用手掌拍打培养瓶侧面，使圆细胞从培养表面释放，直至大部分细胞脱落。
7. 将5 mL胰蛋白酶抑制剂溶液（T6414）移液至培养瓶，以抑制进一步的胰蛋白酶活动。
8. 将细胞悬浮液从培养瓶转移至50 mL无菌锥形管中。
9. 用另外的5 mL胰蛋白酶抑制剂溶液（T6414）冲洗培养瓶，并将溶液转移到同一个锥形管中。
10. 在显微镜下观察T-75培养瓶（SIAL0641）。如果培养瓶中剩余> 20％的细胞，请重复步骤2-9。
11. 将锥形管以220×g离心5分钟以沉淀细胞。
12. 从锥形管中吸取上清液而不扰动细胞沉淀。
13. 用手指轻弹锥形管的尖端以松开细胞沉淀。
14. 用移液管轻轻吸排细胞以使团块散开，将细胞重悬于2 mL内皮细胞生长培养基（211-500）中。
15. 用血细胞计数板或细胞计数器计数细胞。如想使细胞快速生长，则接种密度为10,000个细胞/cm²，如想使细胞进行常规传代培养，则则接种密度为5,000个细胞/cm²。