人毛囊真皮乳头细胞(HFDPC)培养方案

储存方法

培养的准备工作。

HFDPC培养

FDPC传代培养

材料

I. 储存

A. 冻存管(602-05a)

将细胞放入冻存管后须立即储存在液氮储罐中。

*从液氮储罐中取出冻存管时，请务必戴上面罩和手套。从液氮储罐到房间的剧烈温度变化可以导致冻存管中存留的任何液氮爆裂并造成人员受伤。

II.培养的准备工作。

1. 确保具有HEPA过滤层流的II级生物安全柜处于正常工作状态。
2. 用70％酒精对生物安全柜消毒。
3. 在开始细胞培养工作之前，打开生物安全柜风机10分钟。
4. 确保所有血清移液器、移液器吸头和试剂溶液都是无菌的。
5. 遵循标准灭菌技术和安全规则：
   a.    请勿用嘴吸移液。
   b.    在处理人体细胞时，请始终戴上手套和护目镜，即使所有菌株都已
         检测HIV、乙型肝炎和丙型肝炎为阴性，亦应有适当保护。
   c.    在无菌罩中进行所有细胞培养工作。

III.HFDPC培养

A. 为HFDPC培养准备细胞培养瓶

1. 冰箱中取出胶原蛋白包被T-75培养瓶（125-75）和毛囊真皮乳头细胞生长培养基（611-500），并静置恢复室温。
2. 在无菌超净台内使用70%酒精对培养基瓶和细胞培养瓶消毒。
3. 吸取15 mL毛囊真皮乳头细胞生长培养基（611-500）* 加入胶原蛋白包被T-75培养瓶（125-75）中。
   *保持培养基与表面积的比例在1-1.5mL：5 cm²之间。
   - 对T-25培养瓶（SIAL0639）或60 mm组织培养皿（SIAL0166）为5 mL。
   - 对T-75培养瓶（SIAL0641）或100 mm组织培养皿（SIAL0167）为15 mL。

B. 解冻和接种HFDPC

1. 准备一个15 mL无菌锥形管并加入12 mL毛囊真皮乳头细胞生长培养基（611-500），用于清洗HFDPC。
2. 佩戴合适的护目镜和手套，从液氮罐中取出HFDPC冻存管。
3. 将小管的下半部分放在37°C水浴中快速解冻细胞，并在解冻过程中密切观察小管。
4. 当冻存管内仅剩下少量冰时，从水浴中取出冻存管。请勿让细胞完全解冻。
5. 从水浴中取出冻存管并擦干。
6. 在无菌生物安全柜中用70％酒精对小管外部消毒。
7. 小心取下小管盖。不要触碰管盖或冻存管的边缘。
8. 使用2 mL移液管轻轻吹打管内细胞5次，使细胞分散。小心不要过于剧烈地移液以免起泡。
9. 用移液管从冻存管中取出细胞悬液（1 mL）并轻轻转移至准备好的15 mL锥形管中。
10. 室温200 x g离心5分钟，使细胞沉至管底。
11. 从锥形管中吸取上清液而不扰动细胞沉淀。
12. 用移液管轻轻吹打细胞以分散细胞团块，使细胞重悬于 2 mL毛囊真皮乳头细胞生长培养基（611-500）中。
13. 将2 mL细胞混悬液转移至含15ml毛囊真皮乳头细胞生长培养基（611-500）的胶原蛋白包被T-75培养瓶（125-75）。
14. 紧紧盖上瓶盖，轻轻旋转培养瓶，使细胞均匀分布在瓶中。
15. 将T-75培养瓶放在37 ^oC、5% CO₂加湿培养箱中。松开盖子以便换气。
16. 每隔一天更换毛囊真皮乳头细胞生长培养基（611-500），直至细胞达到60%融合。
17. 当培养细胞融合率达到60%以上或周末饲喂时，将毛囊真皮乳头细胞生长培养基（611-500）用量加倍。
18. 当HFDPC达到80%融合时，进行细胞传代。

IV.FDPC传代培养

A. 准备传代试剂

1. 从-20°C冰箱中取出胰蛋白酶-EDTA溶液（T3924）和胰蛋白酶抑制剂（T6414），并在冰箱中解冻一夜。
2. 确保解冻所有传代培养试剂。轻轻旋转每个瓶子几次，形成均匀的溶液。
3. 将所有传代培养试剂储存在4°C以备将来使用。
4. 等分胰蛋白酶/EDTA溶液（T3924），如果只需要一部分胰蛋白酶/EDTA（T3924），则将未使用的部分保存在-20°C。

B. 准备培养瓶

1. 将胶原蛋白包被溶液（125-50）轻轻旋转几次，将溶液混合均匀。
2. 从冰箱中取出毛囊真皮乳头细胞生长培养基（611-500）。在无菌超净台中用70％酒精给瓶子消毒。
3. 在T-225培养瓶（CLS431082）中加入10 mL胶原蛋白包被溶液（125-50），然后轻轻摇动培养瓶，使溶液均匀分布在全部培养表面。
4. 在室温下包被培养皿1-2小时。
5. 在无菌超净台中，吸出胶原蛋白包被溶液（125-50）。
6. 使用杜氏磷酸盐缓冲生理盐水（D8537）清洗包被培养瓶三次，最后一次清洗时从培养瓶中吸出全部清洗液。包被培养瓶可立即使用或装在密封袋中置于4 °C保存最长2周。
7. 吸取45 mL毛囊真皮乳头细胞生长培养基（611-500）加入该包被T-225培养瓶（CLS431082）中，作为用于传代培养的包被培养瓶，并等待接种。

B. HFDPC传代培养

在室温下对细胞进行胰蛋白酶消化。请勿将任何试剂加热至37°C。

1. 从培养瓶吸取培养基。
2. 用HBSS（H6648）洗涤单层细胞，吸除溶液。
3. 取5 mL胰蛋白酶/EDTA溶液（T3924）加入T-75培养瓶中。轻轻摇动培养瓶以确保溶液覆盖所有细胞。
4. 立即取出4.5 ml溶液。
5. 重新盖紧培养瓶盖子，并在倒置显微镜下在室温下监测胰蛋白酶消化过程。细胞通常需要1至3分钟才能变圆。
6. 用手掌拍打培养瓶侧面，使圆细胞从培养表面释放，直至大部分细胞脱落。
7. 将5 mL胰蛋白酶抑制剂溶液（T6414）移液至培养瓶，以抑制进一步的胰蛋白酶活动。
8. 将细胞悬浮液从培养瓶转移至50 mL无菌锥形管中。
9. 用另外的5 mL胰蛋白酶抑制剂溶液（T6414）冲洗培养瓶，并将溶液转移到同一个锥形管中。
10. 在显微镜下检查T-75培养瓶。如果培养瓶中剩余> 20％的细胞，请重复步骤2-9。
11. 将锥形管以220×g离心5分钟以沉淀细胞。
12. 从锥形管中吸取上清液而不扰动细胞沉淀。
13. 用手指轻弹锥形管的尖端以松开细胞沉淀。
14. 用移液管轻轻吹打细胞以分散细胞团块，使细胞重悬于 2 mL毛囊真皮乳头细胞生长培养基（611-500）中。
15. 用血细胞计数板或细胞计数器计数细胞。如想使细胞快速生长，则接种密度为10,000个细胞/cm²，如想使细胞进行常规传代培养，则则接种密度为6,000个细胞/cm²。