人前脂肪细胞(HPAd)培养方案

I. 储存

A. 冻存管 (802s-05a, 802h-05a, S802s-05a)

将细胞放入冻存管后须立即储存在液氮储罐中。

*从液氮储罐中取出冻存管时，请务必戴上面罩和手套。从液氮储罐到房间的剧烈温度变化可以导致冻存管中存留的任何液氮爆裂并造成人员受伤。

II.培养的准备工作。

1. 确保具有HEPA过滤层流的II级生物安全柜处于正常工作状态。
2. 用70％酒精对生物安全柜消毒。
3. 在开始细胞培养工作之前，打开生物安全柜风机10分钟。
4. 确保所有血清移液器、移液器吸头和试剂溶液都是无菌的。
5. 遵循标准灭菌技术和安全规则：
   a.请勿用嘴吸移液。
   b.在处理人体细胞时，请始终戴上手套和护目镜，即使所有菌株都已
   检测HIV、乙型肝炎和丙型肝炎为阴性，亦应有适当保护。
   c.在无菌超净台中进行所有细胞培养工作。

III.HPAd培养

A. 为HPAd培养准备细胞培养瓶

1. 从冰箱中取出人前脂肪细胞生长培养基（811-500）。在无菌超净台中用70％酒精给瓶子消毒。
2. 吸取15 mL人前脂肪细胞生长培养基（811-500）*置于T-75培养瓶（SIAL0641）中。
   *保持培养基与表面积的比例在每5 cm² 1 mL。
   例如：
   - 对T-25培养瓶（SIAL0639）或60 mm组织培养皿（SIAL0166）为5 mL。
   - 对T-75培养瓶（SIAL0641）或100 mm组织培养皿（SIAL0167）为15 mL。

B. 解冻和接种HPAd

1. 在眼睛和手都有适当保护的情况下，从液氮储罐取出冷冻保存的HUVEC小管。
2. 将瓶盖转动四分之一圈，以释放可能被困在螺纹中的液氮，然后重新拧紧瓶盖。
3. 将小管的下半部分放在37°C水浴中快速解冻细胞，并在解冻过程中密切观察小管。
4. 当小管中仅有少量冰时，从水浴中取出小管。请勿让细胞完全解冻。
5. 在无菌生物安全柜中用70％酒精对小管外部消毒。
6. 小心取下小管盖。请勿用手触摸盖子或小管的边缘，以免污染。
7. 用2 mL移液管轻轻吹5次，将细胞重悬于小管中。小心不要过于剧烈地移液以免起泡。
8. 用移液管从冻存管中取出细胞悬液（1mL）并轻轻转移至装有15 mL人前脂肪细胞生长培养基（811-500）的T-75培养瓶（SIAL0641）中。
9. 盖上培养瓶并轻轻摇动，使细胞均匀分布。
10. 将T-75培养瓶（SIAL0641）置于37 ^oC、5% CO₂ 加湿培养箱中。松开盖子以便换气。为获得最佳结果，接种后24小时之内不要扰动培养物。
11. 接种24小时后或过夜后，更换新鲜的人前脂肪细胞生长培养基（811-500），以去除所有残留的DMSO。
12. 每隔一天更换一次人前脂肪细胞生长培养基（811-500），直至细胞达到60%融合度。
13. 当培养细胞融合度达到60%以上或周末饲喂时，将人前脂肪细胞生长培养基(811-500)用量加倍。
14. 当HPAd达到85-95%融合时，进行细胞传代。

IV.HPAd传代培养

A. 准备传代试剂

1. 从-20°C冰箱中取出胰蛋白酶-EDTA溶液（T3924）和胰蛋白酶抑制剂（T6414），并在冰箱中解冻一夜。
2. 确保解冻所有传代培养试剂。轻轻旋转每个瓶子几次，形成均匀的溶液。
3. 将所有传代培养试剂储存在4°C以备将来使用。
4. 等分胰蛋白酶/EDTA溶液（T3924），如果只需要一部分胰蛋白酶/EDTA（T3924），则将未使用的部分保存在-20°C。

B. 准备培养瓶

1. 从冰箱中取出人前脂肪细胞生长培养基（811-500）。在无菌超净台中用70％酒精给瓶子消毒。
2. 吸取35 mL人前脂肪细胞生长培养基（811-500）置于T-175培养瓶（SIAL1080）中（用于第IV C部分第15步）。

C. HPAd传代培养

在室温下对细胞进行胰蛋白酶消化。请勿将任何试剂加热至37°C。

1. 从培养瓶吸取培养基。
2. 用HBSS（H6648）洗涤单层细胞，吸除溶液。
3. 移取6 mL胰蛋白酶/EDTA 溶液（T3924）至T-75培养瓶（SIAL0641）。轻轻摇动培养瓶以确保溶液覆盖所有细胞。
4. 立即吸取5 mL的溶液。
5. 重新盖紧培养瓶盖子，并在倒置显微镜下在室温下监测胰蛋白酶消化过程。细胞通常需要1至3分钟才能变圆。细胞在胰酶消化过程中可能不会完全变圆，并且有些细胞可能会在脱离培养表面后依然处于消化进程中。
6. 用手掌拍打培养瓶侧面，使圆细胞从培养表面释放，直至大部分细胞脱落。
7. 将5 mL胰蛋白酶抑制剂溶液（T6414）移液至培养瓶，以抑制进一步的胰蛋白酶活动。
8. 将细胞悬浮液从培养瓶转移至50 mL无菌锥形管中。
9. 用另外的5 mL胰蛋白酶抑制剂溶液（T6414）冲洗培养瓶，并将溶液转移到同一个锥形管中。
10. 在显微镜下观察T-75培养瓶（SIAL0641）。如果培养瓶中剩余> 20％的细胞，请重复步骤2-9。
11. 将锥形管以220×g离心5分钟以沉淀细胞。
12. 从锥形管中吸取上清液而不扰动细胞沉淀。
13. 用手指轻弹锥形管的尖端以松开细胞沉淀。
14. 用移液管轻轻吹打细胞以分散细胞团块，使细胞重悬于5 mL人前脂肪细胞生长培养基（811-500）中。
15. 用血细胞计数板或细胞计数器计数细胞。如想使细胞快速生长，则接种密度为10,000个细胞/cm²，如想使细胞进行常规传代培养，则则接种密度为6,000个细胞/cm²。

V. HPAd分化

A. 用于分化的HPAd接种

1.根据下表所述，调整人前脂肪细胞生长培养基（811-500）体积，使细胞溶液达到目标细胞密度
。

2.将前脂肪细胞以44,000个细胞/cm²的密度接种至所需培养板中，使细胞分化。

3.将细胞置于37 °C、5% CO₂加湿培养箱中培养。

4.当细胞达到100%融合且细胞铺满培养表面时，开始分化。细胞通常需要1-2天
    才能达到完全融合。

B. 准备分化培养基

1. 从冰箱中取出人脂肪细胞分化培养基（811D-250）。在无菌超净台内使用70%酒精对培养基瓶消毒。
2. 按所需体积分装人脂肪细胞分化培养基（811D-250），松开分装瓶盖并在37 °C、5% CO₂加湿培养箱中平衡2小时，以便气体交换并使培养基预热至37°C。

C. HPAd分化为HAd

在更换培养基时，避免细胞干燥。

HPAd必须达到100%融合且铺满培养表面，才能开始分化。

1. 从培养瓶中吸出生长培养基。
2. 根据第V.A.部分第1步所述，加入合适体积的人脂肪细胞分化培养基（811D-250）。
3. 将加入人脂肪细胞分化培养基（811D-250）的细胞置于37 °C、5% CO₂加湿培养箱中培养。
4. 每3天更换一次新鲜的人脂肪细胞分化培养基（811D-250），共培养15天。
5. 在第15天结束时，细胞分化成含有脂肪滴的HAd细胞。
6. 在检测前，取出人脂肪细胞分化培养基（811D-250），然后加入人脂肪细胞饥饿培养基(811S-250)进行饥饿培养1天。