背景
β-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶，通常缩短为β-葡糖醛酸酶，在药物筛选和药物代谢研究中，对代谢物所进行的生物流体分析中，起着重要作用。β-葡萄糖醛酸苷酶通过图1所示的一般途径将葡萄糖醛酸苷代谢物水解回天然母体药物1。对于液相色谱分析方法，形成的高极性葡糖苷酸代谢物在反相色谱分离中不易保留，因此影响了分析方法的定量能力。葡糖苷酸代谢物的水解对于气相色谱方法是必需的。这通常还包括增加二级衍生化以进行有效分析和检测。
由于酶在碳水化合物代谢中的重要作用，酶在整个生命系统中无处不在。虽然有许多β-葡糖醛酸酶可用，但每种酶都具有水解葡糖苷酸代谢物的最佳条件。β-葡糖醛酸酶浓度、消化pH、孵育时间和温度等变量，都对葡糖苷酸代谢物的有效水解起着重要作用。
图 1.β-葡糖醛酸酶水解反应
研究目标
这里提出的研究目标是确定不同物质的β-葡糖醛酸酶对不同化合物类别的水解的最佳条件，随后用UHPLC / MS（TOF）进行分析。研究将针对一些关键变量，它们在选择合适的β-葡糖醛酸酶和培养条件时发挥作用，使葡糖苷酸代谢物有效水解成母体药物形式。在该研究中，通常会在分析之前进行水解的一组化合物将被用来评估一系列β-葡糖醛酸酶来源和形式的有效水解的条件。研究评估了β-葡糖醛酸酶的各种菌株。研究中包括五种药物类别，它们是：阿片类药物、苯二氮卓类药物、类固醇、大麻素和疼痛控制药物，以及11种不同来源、类型或配方的β-葡糖醛酸酶（表1和表2）。
实验
制备葡糖苷酸标准品和加标尿液样品
在水中制备每种葡糖苷酸代谢物的10 μg/mL的原液。用每种葡糖苷酸代谢物以200 ng/mL对人尿液加标。
制备β-葡糖醛酸酶溶液
用以下列方法由冻干形式的β-葡糖醛酸酶制备溶液：在pH 5.0和6.0的100 mM乙酸铵缓冲液中，制备每种β-葡糖醛酸酶的50 kU/mL原液。不使用时，溶液保存在4°C下。液体形式按供应的原样使用。
用β-葡糖醛酸酶消化样品
制备加标尿液样品原液，体积为10 mL，供多次重复取样。尿液样品以200 ng/mL加标掺入测试化合物的所有葡糖苷酸代谢物。向10 mL尿样中加入2 mL每种对应的pH缓冲液，然后加入2 mL β-葡糖醛酸酶溶液。所得β-葡糖醛酸酶的浓度为每尿样10 kU/mL。
然后将尿样在60℃下在对流烘箱中消化120分钟。将样品从烘箱中取出并冷却。取出 1.4 mL 等分试样，使用固相萃取（SPE）进一步制备样品，然后用 UHPLC/MS（TOF）分析。
水解变量
作为这一优化研究的组成部分，进行实验以评估孵育时间、孵育温度、pH和酶浓度对葡糖苷酸代谢物向其相应母体药物转化的影响。虽然这些条件是酶转化的重要部分，但完整的实验细节超出了本报告的范围。测试的孵育时间、温度、pH和酶浓度范围如下：
- 孵育时间：30分钟，60分钟，120分钟
- 孵育温度：45 °C，55 °C，60 °C，65 °C
- 孵育 pH：4.5，5，6
- β-葡糖醛酸酶浓度：10 kU/mL 和 50 kU/mL
孵育时间
对于测试的大多数酶，在30分钟的短孵育时间内观察到葡糖苷酸代谢物快速转化为母体药物。对于所有药物/β-葡糖醛酸酶组合，120分钟孵育时间是最佳转化时间。随后的实验按120分钟的孵育时间标准化。
孵育温度和酶浓度
孵育温度在酶活性中起重要作用。β-葡糖醛酸酶浓度的作用不是时间或温度的重要限速步骤。在120分钟的孵育时间研究中，在10 kU/mL至50 kU/mL之间未观察到转化率的显著增加。10 kU/mL酶浓度是掺入的最低水平。在孵育温度高于65℃的情况下，在50 kU/mL酶浓度下葡糖苷酸转化率显著降低。进一步的研究集中于10 kU/mL酶浓度。
孵育pH
在评估的所有消化条件中，孵育pH对β-葡糖醛酸酶活性的有效性具有最显著影响。由于pH具有如此重大的影响，本研究所报告的大部分结果都集中在样品pH的作用以及各种β-葡糖醛酸酶的有效性上。pH研究的实验条件如下：
- 孵育时间：120分钟
- 孵育温度：60 °C
- β-葡糖醛酸酶浓度：10 kU/mL
- 孵育 pH：4.5，5.0，6.0
- 尿液中的分析物浓度：200 ng/mL
固相萃取（SPE）法
SPE可去除多余的酶，这些酶可以干扰分析并污染HPLC色谱柱。使用混合模式阳离子交换/疏水固定相通过SPE处理样品。使用碱性乙腈洗脱溶剂从SPE管中洗脱原始（母体）药物。重复进行所有样品处理（n = 4）。
- SPE 管/滤芯：Supel™-Select SCX，60 mg/3 mL（产品编号：54241-U）
- 调节步骤: 1 mL 1％甲酸的乙腈溶液，然后用1 mL水
- 上样：1.4 mL加标和水解尿液
- 洗涤步骤：2 mL水，然后用1 mL 25％（v/v）甲醇水溶液
- 洗脱：1 mL 10％（w/v）氢氧化铵的乙腈溶液
- 样品后处理：在氮气下蒸发，并在1 mL水中重新配制
UHPLC / MS（TOF）条件
所有分析均在Titan™ C18 1.9 µm UHPLC柱上用梯度洗脱进行。将该类化合物的葡糖苷酸代谢物标准品加入对照尿液样品中以测定水解转化率。然后将尿样中葡糖苷酸代谢物的已知浓度用于计算向母体药物的转化率。使用原始母体药物的标准溶液（10-300 ng/mL，在水中）在UHPLC MS / TOF系统上制出校准曲线。色谱条件如图2所示。
图 2.在β-葡糖醛酸酶酶消化后使用Supel-Select SCX进行固相萃取（SPE）之后，在Titan C18上进行药物及其葡糖苷酸代谢物的LC/MS（TOF）分析
条件
柱：Titan C18，5 cm ~ 2.1 mm I.D.，1.9 µm 颗粒(产品编号 577122-U)；流动相：[A] 5 mM甲酸铵；[B]乙腈：水（95：5）中的5 mM甲酸铵；梯度：在 2.5 min内，由5 至 90％ B，保持 0.5 min；在 0.1 min内至 5％ B，保持 2 min；流量：0.3 mL/min；色谱柱温度：35 °C；探测器：MS，ESI（+），全扫描，m/z 100-1000；注射：2 µL；样品：尿液中掺入了葡萄糖醛酸苷代谢产物，经水解后通过SPE萃取，终浓度为 100 ng/mL；系统：配备Agilent 6210 TOF的Agilent 1290 Infinity
结果
表 3总结了每种药物的优化酶水解条件。图 2显示了从尿液中水解和提取的测试化合物，在Titan C18柱上分离，并通过LC/MS（TOF）分析后的色谱图。
在这些梯度条件下，关键的可待因和氢可酮对具有足够的分辨率。这极为重要，因为这些化合物是等压的。没有观察到样品基质干扰，这表明样品制备方法是有效的。
pH对β-葡糖醛酸酶水解的影响
消化过程中使用的pH值是所有设计变量中最重要的因素。例如，图3显示了使用大肠杆菌IX-A型酶在三种pH条件下的葡糖苷酸水解。对于所有化合物类别，在pH 4.5仅发生了微小水解，但pH 5和pH 6则有显著水解。pH 5以上的水解取决于化合物类别。苯二氮卓类药物、疼痛控制和类固醇测试化合物在pH 5以上具有显著的转化率，而阿片类药物在任何pH值下仅具有微小的转化率。这表明大肠杆菌IX-A型酶不适合作为葡糖苷酸代谢物的一般水解酶，但可能适用于特定类别的化合物。
图 3.大肠杆菌IX-4型β-葡萄糖醛酸酶（产品编号 G7396）：pH值对水解效率的影响
为了比较，pH对笠贝（Patella vulgata）β-葡糖醛酸酶L-II 型水解的影响显示在图 4中。在所有孵育pH值下观察到所有类别化合物的水解。在pH 5下观察到所有类别的最佳水解，但这不一定是每个类别的最佳pH。苯二氮卓类药物在pH 5时具有最佳水解，而阿片类药物在pH 6下具有最佳水解。这些结果表明，笠贝L-II 型β-葡糖醛酸酶可能适合作为不依赖于化合物类别的通用水解酶。
图 4.笠贝（P）β-葡萄糖醛酸酶 L-II 型（产品编号 G8132）：pH值对水解效率的影响
表3中总结的实验结果表明了每种化合物类别的特定化合物的最佳水解条件。这些结果表明了每种特定化合物的最高水解水平，但可能不是整个类别的最佳条件。在苯二氮卓类葡糖苷醛的情况下，大肠杆菌酶确实对测试的所有苯二氮卓类提供了最佳转化率。在阿片类药物的情况下，水解条件随阿片葡糖苷酸的不同而不同。在这种情况下，β-葡糖醛酸酶 / 化合物的组合比通用类别具有更强的化合物特异性。大肠杆菌β-葡糖醛酸酶对类固醇和大麻素测试分析物的转化率最高。
结论
为了使用β-葡糖醛酸酶优化水解，必须对每种待分析的葡糖苷酸代谢物进行某些因素的评估，例如孵育时间、温度、水解pH、酶源和酶浓度。在本文报道的研究中，水解pH被确定为尿液中葡糖苷酸代谢物有效水解的最重要因素。在某些情况下，特定的β-葡糖醛酸酶对于一整类葡糖苷酸代谢物的水解是有效的。然而，在大多数情况下，最佳水解条件取决于化合物。
就通用酶而言，来自笠贝（Patella vulgata）的β-葡糖醛酸酶水溶液（产品编号：G2174）在所有pH条件下对本研究中包括的所有类别的化合物给出了最佳总体转化率。这不一定是每种类别或特定化合物的最佳水解条件，但是无论水解pH如何，对于所有类别，笠贝β-葡糖醛酸酶都产生足够的水解。为了在特定的β-葡糖醛酸酶和水解pH下进行最佳水解，本研究中所有类别化合物的总体转化率的最佳条件，是用来自B-1型牛肝（产品编号：G0251）的β-葡糖醛酸酶在pH 5条件下观察到的。
参考文献
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