一般描述
体外转录生成的CRISPR Cas9-D10A切口酶mRNA具有帽子和polyA尾巴结构。该mRNA应该与纯的向导RNA一起使用。使用RNA和质粒构建体，可避免启动子-胚胎兼容性问题以及核酸酶和gRNA表达质粒随机整合到宿主动物基因组的可能性。
应用
功能性基因组学/转基因应用
- 在转基因应用中，建立基因敲除
- 建立基因敲入动物，将启动子、融合标签或报告基因整合到内源性基因中
特点和优势
RNA可立即用于转基因应用。为了介导DNA位点特异性双链断裂，必须与两条纯的向导RNA序列一起使用。最新证据表明，CRISPR内切酶的脱靶效应是一个重要问题。为了解决这一问题，Sigma开发的配对切口酶技术可将CRISPR DNA识别域的长度延长至与ZFN和TALEN相近。我们的经验表明，基于Cas9-D10A突变体的配对切口酶是最可靠的。我们的开发工作也证明，产生活性配对切口酶的关键因素在于gRNA在5′至5′方向上的定位。对于配对CRISPR切口酶的RNA递送，我们建议使用由Cas9-D10A mRNA和2个T7生成向导RNA序列组成的三元系统。为了简化配对切口酶的使用，可通过Sigma的在线工具进入预设计配对切口酶库。请查看Sigma在线CRISPR产品，获取最新设计方案集。
组分
1管含25μg Cas9-D10A 切口酶mRNA。
请注意，该产品不含向导RNA序列。向导RNA必须通过定制CRISPR产品选项卡单独购买。
请注意，该产品不含向导RNA序列。向导RNA必须通过定制CRISPR产品选项卡单独购买。
原理
CRISPR/Cas是细菌和古细菌的一种防御系统，可用来对抗入侵的病毒和质粒。来自酿脓链球菌的II型CRISPR/Cas系统包含两种分子元件，即一个Cas9蛋白和一个非编码向导RNA（gRNA），该系统经过基因改造而被用于真核系统中。Cas9核酸内切酶可在单个gRNA的引导下，在指定基因组位置上引入DNA双链断裂（DSB）。与锌指核酸酶（ZFN）诱导的DSB相似，细胞随后会激活内源性DNA修复程序，即非同源性末端接合（NHEJ）或同源重组修复机制（HDR），对目标DSB进行修复。
外形
Sigma Cas9-D10A 切口酶mRNA的浓度为500 ng/μl（50 μl Cas9 mRNA，具有帽子和polyA尾巴结构）
制备说明
尽管Sigma高质量的RNA合成工艺已成功用于许多基于mRNA的ZFN转基因项目，但是为了确保去除所有可能堵塞显微注射针头的颗粒物，我们仍强烈建议您在进行显微注射前，将最终调整过浓度的CRISPR RNA样品进行离心。
其他说明
为了介导DNA双链断裂，必须与两条向导RNA序列一起使用。
尽管Sigma CRISPR RNA不是针对稳定的细胞培养而开发的，但是，我们已经发现使用RNA形式的CRISPR核酸酶和配对切口酶检测CEL-I活性的一些成功案例。RNA递送系统可能更适用于对双链DNA较敏感的细胞类型（如树突细胞）或启动子与细胞不兼容的情况。
文献中使用的Cas9-D10A 切口酶mRNA和gRNA标准显微注射浓度范围分别为20-200 ng/μl和10-50 ng/μl。
尽管Sigma CRISPR RNA不是针对稳定的细胞培养而开发的，但是，我们已经发现使用RNA形式的CRISPR核酸酶和配对切口酶检测CEL-I活性的一些成功案例。RNA递送系统可能更适用于对双链DNA较敏感的细胞类型（如树突细胞）或启动子与细胞不兼容的情况。
文献中使用的Cas9-D10A 切口酶mRNA和gRNA标准显微注射浓度范围分别为20-200 ng/μl和10-50 ng/μl。
法律信息
WGK
WGK 1
闪点(°F)
Not applicable
闪点(°C)
Not applicable
法规信息
常规特殊物品
实验方案
Learn about CRISPR Cas9, what it is and how it works. CRISPR is a new, affordable genome editing tool enabling access to genome editing for all.
了解CRISPR Cas9、定义和工作原理。CRISPR是一种全新、实惠的基因组编辑工具，可让所有人掌握基因组编辑。
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默克Sigma-Aldrich® Advanced Genomics提供了一整套用于基因敲减和过表达实验的优化CRISPRi和CRISPRa文库目前可提供CRISPRi和SAM CRISPRa混合的慢病毒文库，也可根据您的特定需求提供定制产品。
Sigma-Aldrich® Advanced Genomics is the leading provider of gene editing and silencing technologies including CRISPR, Cas9, synthetic guide RNA (sgRNA), and Zinc Finger Nuclease (ZFN).
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