间充质干细胞扩展培养基（1x）

细胞解冻：

1.在准备推荐的培养基和适当的塑料器皿和/或玻璃器皿之前，请勿解冻细胞。
2.从液氮中取出间充质干细胞小瓶，在37°C水浴中孵育。 密切监测直至细胞完全解冻。 最大的细胞活率取决于冷冻细胞的快速和完全解冻。 重要说明： 不要对细胞进行涡旋！
3.一旦细胞完全解冻，用70%乙醇对小瓶外部进行消毒。 立即进行下一步。
4.在层流罩中，使用1或2 mL移液器将细胞转移到无菌的15 mL锥形管中。 转移过程中注意不要引入任何气泡。
5.使用10 mL移液器，向15 mL锥形管中缓慢滴加9 mL间充质干细胞扩增培养基（预热至37°C）。 重要说明： 不要立即向细胞中加入全部体积的培养基。 由于渗透性休克，这可能导致细胞活率降低。
6.缓慢上下吹打两次，轻轻混匀细胞悬液。 注意不要引入任何气泡。 重要说明： 不要对细胞进行涡旋！
7.将锥形管以300 x g离心2-3分钟，使细胞沉淀。
8.尽可能多地倾去上清液。 步骤4-8是去除残留冷冻保存剂（DMSO）所必需的。
9.将细胞重悬于总体积为10 mL的间充质干细胞扩增培养基（预热至37°C）中。
10.将细胞混合物铺在10-cm组织培养板上。
11.在37°C、5%CO₂加湿培养箱中培养细胞。
12.第二天，用新鲜的间充质干细胞扩增培养基（预热至37°C）交换培养基。 此后每两到三天与新鲜培养基交换一次。
13.当细胞约80%融合时，可以用Accutase^®将其解离并传代，或者冷冻以备后用。

传代培养：

1.小心地从含有间充质干细胞融合层的10-cm组织培养板中取出培养基。
2.应用3-5 mL Accutase，并在37°C培养箱中培养3分钟。
3.检查平板，用手掌轻轻敲击平板侧面，确保细胞完全分离。4.在平板上应用5 mL间充质干细胞扩增培养基（预热至37°C）。
5.将解离的细胞转移至15 mL锥形管中。
6.将锥形管以300 x g离心2-3分钟，使细胞沉淀。
7.弃去上清液
8.向锥形管中加入2 mL间充质干细胞扩增培养基，彻底重悬细胞。重要说明： 不可涡旋。
9.使用血细胞计数仪计数细胞量。
10.将细胞以所需密度铺板于间充质干细胞扩增中适当的烧瓶、板或孔中。 我们通常以每10厘米平板或T75烧瓶约200万个细胞的速度铺板细胞。

测试每批培养基的最佳细胞生长和间充质干细胞的增殖。 无菌测试： 阴性

间充质干细胞扩增培养基是含有胎牛血清的专有配方。

间充质干细胞扩增培养基应储存于-20°C，直到使用。 解冻后，基础培养基应在2-8°C下储存长达一个月。

Accutase is a registered trademark of Innovative Cell Technologies, Inc.

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

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