IVD侧向层析 – 样品垫、结合垫和吸附垫的基础知识
样品垫、结合垫和吸附垫材料
侧向层析垫由可用于样品垫、偶联垫和吸附垫的多孔基质制成。最常见的做法是：纤维素材料（即滤纸）用于样品垫和吸收垫，玻璃纤维滤膜用于结合垫。我们提供了一系列SureWick®纤维素和玻璃纤维材料（表 1）。这类材料更容易制造，成本通常比硝化纤维素膜更低。然多数情况下，这类材料并非专为侧向层析制造。
根据层析垫材料的来源，它们可能缺乏侧向层析相关的指标，且差异水平超出预期——尤其是在侧向层析检测所用的尺寸方面。编织网和合成无纺布等其他材料也可用作层析垫材料，但使用频率要低得多。
SureWick®垫材料化学成分
样品垫和结合垫复杂承载进行侧向层析检测必需的化学物质。下文介绍了每种层析垫的具体详情。关于这类化学品，人们常常忽略了一个重要因素。加入均质溶液并蒸发掉水分，将化学品上样到这些层析垫中。不同溶质的溶解度不同，因而在蒸发过程中可能会变得不均匀。液体成分（例如TWEEN® 20）会恢复到高度浓缩状态，且可能不会均匀分布在层析垫的纤维网络中。样品加到试纸条上后，溶解速率取决于它们固有的溶解度和分子界面处的混合速率。将样品加到试纸条上时， 合理推断这些成分不会以相同的速率复溶。因此，溶解速度更快的成分将更加集中在液体前沿附近，而溶解速度更慢的成分将延迟释放到液流中。这些现象的最终效果是，当液流穿过层析垫并到达膜上时，在液流内产生一组化学梯度。
液流内可能存在不利于抗体和分析物之间相互作用的化学物质浓度。
样品垫选择和规格
样品垫（图 1）可用于执行多项任务，其中最重要的是促进样品在结合垫上均匀受控分布。它还可以控制液体进入结合垫的速率，防止设备被淹没。样品垫用蛋白质、去垢剂、粘度增强剂和缓冲盐等成分浸渍后，还可用于：
- 增大样品粘度（调节流动特性）。
- 增强样品溶解检测试剂的能力。
- 防止结合物和分析物与任何下游材料非特异性结合。
- 改变样品的化学性质，使其支持测试线上的免疫复合物形成。
- 促进样品沿膜均匀流动。
加入的蛋白质（如白蛋白）以及去垢剂和表面活性剂（如低浓度的 SDS 或 TWEEN® 20）可能会促进结合物复溶、减少结合物非特异性结合，并可能最大限度避免分析物吸附膜。
图 1.样品垫
向样品垫加入封闭剂，可省去膜封闭步骤。这一方法可能比直接封闭膜更易操作，更具成本效益。除非抗体（或抗原）共价连接到检测器颗粒上，否则不建议在存在封闭蛋白或去垢剂的情况下在结合垫中干燥检测器试剂。外源蛋白质——尤其是在存在去垢剂的情况下——可能会在长期储存过程中取代检测器颗粒上的抗体或抗原。因此，除膜之外，样品垫可能是测试装置中唯一适合安全加入封闭剂和复溶剂的位置。
部分检测需要化学成分表现悬殊的样品。例如，人类尿液的 pH 值在 5 到 10 之间。pH 和离子强度差异可能会改变捕获和检测试剂的特异性和灵敏度，并由于电荷密度变化导致检测试剂出现不同程度的非特异性结合。向样品垫中加入相对高浓度的缓冲盐（如用 pH 9.5 的 1.0 M 硼酸盐缓冲液进行预处理）可控制从样品垫中流出的溶液 pH 值和离子强度，最大限度减少波动因素。
常用作样品垫材料有两种：纤维素纤维滤膜和编织网。
编织网（有时又称筛网）通常可让样品顺利均匀分布在结合垫上。它们通常还具有良好的拉伸强度，即使潮湿状态也能很方便地处理。筛网的床体积非常小，这意味着它们保留的样品量非常少，通常为1 – 2 μL/ cm2。另一方面，通过上样足量溶质改变测试样品蛋白质含量、pH、离子强度或粘度也不切实际。相对于其他多孔介质，筛网也可能很昂贵，且难以通过切条机进行处理。
纤维素滤膜的特性与编织网几乎相反。它们更厚（> 250 μm）、强度低且相对经济。纤维素滤膜还具有较大的床体积（> 25 μL/ cm2）。滤纸很难操作——尤其是在潮湿情况下。纤维素滤膜是制作样品垫最常用的材料，因为它们可上样多种封闭剂、检测试剂释放剂、pH 和离子强度调节剂以及粘度增强剂。使用纤维素滤膜时，必须小心确保与下方结合垫材料充分均匀接触。如未能实现良好接触并充分压紧，可能导致转移到结合垫中的液体中断或不均匀。
在许多尿液检测方案中——尤其是妊娠和排卵检测方案——从盒的末端伸出多孔塑料吸芯。其主要作用是从尿液中收集液体，以便转移到盒内的试纸条上。吸芯尺寸可量身定制，具体取决于测试盒设计以及进行测试所需吸附的液体量。吸芯可能经过/未经化学处理，具体取决于盒内其他材料的化学性质。我们不难判断，塑料吸芯可起到样品垫的作用。
指定样品垫
样品垫规格很大程度取决于其在测试设备中承担的预期作用。如果样品垫主要用于改变样品，则应指定以下特性：
厚度（平均值和差异范围）
平均厚度可以微米、毫米或千分之一英寸（密耳）为单位。差异范围也很重要，因为这会影响床体积和壳内压紧一致性。对于处于壳中的试纸条，通常将样品加到露出小片样品垫区的端口上。如果样品垫材料太厚，则纤维可能压缩，从而大大减少或阻碍液体吸收到垫中。如果样品垫材料太薄，则可能很少或完全未接触外壳。这会让样品能够畅通无阻地进入外壳，淹没内部，大幅改变试纸条的流动动力学。
基重（平均值和差异范围）
基重是每单位面积的纤维质量。在造纸和无纺布工业中，最常用g/cm2表示。此值与侧向层析检测无关。通过基重、材料厚度和聚合物密度，可以计算床体积和孔隙率。孔隙率恒定的情况下，床体积与厚度成正比。同样，厚度恒定的情况下，床体积与孔隙率成正比。因此，基重变化可以等同于床体积变化。床体积实际上是关键的性能参数，但很少直接提供。
拉伸强度
和膜一样，样品垫材料的拉伸强度也很重要。有些材料的拉伸强度与无背衬膜一样弱。由于它们可能切割成 1 厘米或更小宽度，因此在连续加工操作中卷绕处理可能非常困难。
溶出物
用于制造样品垫的材料含有将纤维固定在一起的粘合剂。此外，一些纤维可能会断裂或不与垫的宏观结构连接。因此，在各种加工步骤中，相当大比例的垫构件可能会脱落。试纸条运行时，样品润湿样品垫并向下游移动时，这可能会导致堵塞和流体流动不畅。
尺寸（长、宽）
应整体指定尺寸和公差。
包装、标签和认证
膜相关的考虑因素同样适用于样品垫材料。
颗粒截留率
在一些应用中，样品垫用作滤膜，在液体进入结合垫之前去除样品中的颗粒。因此，了解颗粒截留率非常重要。由于这些材料是深层过滤器，因此不具有 100% 的截留能力。纸张和无纺材料的制造方式，颗粒截留率改变通常涉及厚度和基重大幅变化。
结合垫选择和规格
结合垫（图 2）可执行多项任务，其中最重要的是将检测试剂和待测样品均匀转移到膜上。样品流入结合垫时，检测器试剂溶解，脱离垫材料并与样品一起移动到膜中。理想的结合垫材料具有以下属性：
- 低非特异性结合：如果检测器试剂或分析物与结合垫结合，则无法在测试线上形成免疫结合物，导致信号强度和灵敏度下降。
- 一致的流动特性：流动特性不一致可能会导致严重的性能问题。如果材料无法让样品均匀地沉积到膜上，则检测器试剂可能导流到膜上；样品沿着膜迁移时，会形成条纹。因此，测试线和控制线信号形成的不均匀。
- 一致的床体积：检测器试剂通过浸渍加样到结合垫中时，每个测试条中的检测器试剂量取决于材料的床体积。如果床体积差异很大，即使试纸条的所有其他成分恒定，也可能观察到不同的信号强度。
- 低溶出物：除化学溶出物外，材料还应不含可能堵塞结合垫/膜界面处膜的颗粒。
- 良好的纸幅处理特性和一致的压缩性能：这些特性必须纳入试纸条制造商的考虑因素，对于确保液体稳定移到膜上非常重要。
图 2.用于侧向层析检测的结合垫。
结合垫对于检测灵敏度的影响
结合垫的一个重要功能是确保每一个试纸条上的样品体积稳定，将检测器颗粒转移到膜上。最终，将检测器颗粒释放到样品流中所需的样品体积决定可测定的分析物量。只有先于检测器颗粒迁移的样品中的分析物，以及与检测器颗粒一同迁移的样品中的分析物才会影响测定信号。检测器颗粒完全释放后进入结合垫和膜的样品体积不会影响信号，但确实有助于减少检测背景（图 3）。 在所有检测器颗粒进一步向下游迁移之后经过捕获试剂管线的分析物，虽然可在捕获试剂线处结合，但缺乏完成免疫复合所需的额外检测器颗粒。试纸条中实际分析的样品体积等于溶解检测器颗粒所需的样品量，而不是设备吸收的总样品量。
图 3.侧向层析检测灵敏度。
结合垫常用的多孔材料是无纺滤膜，由纤维素、玻璃或塑料（例如聚酯、聚丙烯或聚乙烯）纤维压缩成薄垫制成。其性质可通过纤维尺寸、厚度、基重、溶出物和空气流速指定。大多数情况下，它们的成本远低于膜。制造结合垫常用的材料包括玻璃纤维滤膜、纤维素滤膜和表面处理（亲水性）聚酯或聚丙烯滤膜。表 2总结了不同材料的关键特性。
指定结合垫特性
在控制侧向层析检测性能方面，结合垫与膜一样重要。因此，确定关键材料规格非常重要：
厚度（平均值和差异范围）
厚度可以微米、毫米或千分之一英寸（密耳）为单位。厚度范围也很重要，因为这会影响床体积和壳内压紧一致性。
基重（平均值和差异范围）
基重是每单位面积的纤维质量。在造纸和无纺布工业中，最常用g/m2表示。此值与侧向层析检测无关。通过材料厚度和聚合物密度，可以计算床体积和孔隙率。孔隙率恒定的情况下，床体积与厚度成正比。同样，厚度恒定的情况下，床体积与孔隙率成正比。因此，基重变化可以等同于床体积变化。床体积实际上是关键的性能参数，但很少直接提供。
拉伸强度
和膜一样，结合垫材料的拉伸强度也很重要。有些材料的拉伸强度与无背衬膜一样弱。由于它们可能切割成小于 1 厘米的宽度，因此在连续加工操作中卷绕处理可能非常困难。
溶出物
用于制造结合垫的材料可能含有将纤维固定在一起的粘合剂。此外，一些纤维可能会断裂或不与垫的宏观结构连接。因此，在各种加工步骤中，相当大比例的垫构件可能会脱落。试纸条运行时，样品润湿样品垫并向下游移动时，这可能会导致堵塞和流体流动不畅。外部玻璃纤维也会对自动化制造系统造成健康危害。
尺寸（长、宽）
应整体指定尺寸和公差。
包装、标签和认证
膜相关的考虑因素同样适用于结合垫材料。
吸附垫选择和规格
选择吸附垫
使用吸附垫时，将其放置在试纸条的远端（图 4）。吸附垫的主要功能是增加进入试纸条的样品总体积。通过增大样品体积，可将未结合的检测器颗粒从测试线和对照线中洗掉，从而降低背景并提高检测灵敏度。由于最终产生信号的样品体积由溶解检测器颗粒所需的体积——而不是由进入设备的样品总体积决定，因此增加吸附垫可能不会对检测整体灵敏度产生明显影响。如果试纸条设计不含吸附垫，则试纸条分析的样品体积仅由膜的床体积决定。
图 4.用于侧向层析的吸附垫。
关于吸附垫的使用，存在两大考虑因素。首先，必须发现、指定、购买合适的材料并将其融入制造过程。这会最终导致成品成本升高。其次，吸附垫让我们难以将检测中止指示剂植入检测装置。通过吸附垫的液体流不一定是层流，并且吸附垫可能会不可预测地充注液体。
大多数吸附垫由纤维素滤纸制成。应根据厚度、压缩性、可制造性——最重要的是根据床体积均匀性，选择吸附垫材料。选择吸附材料后，最好通过调整吸附垫的尺寸（通常是长度）优化试纸条的总吸附体积。
指定吸附垫
除溶出物外，样品垫的所有指标同样是适用于吸附垫。
考虑不同开发阶段的制造方案
制造方案涵盖了从纯手动到完全自动化的范围。为确保重现性，某些步骤需要高度一致性。
选择正确的制造工艺
工艺选择主要取决于要制造的产品数量以及人员和装备制造设施可用资金。
- 手动 – 批量模式处理材料。
- 自动化 – 连续模式处理材料。
- 手动与自动相结合。
确保制造一致性的关键要素
考虑制造过程的以下要素，确保从研发到制造的一致性。
- 将膜、样品垫、结合垫和吸附垫一致层压到支撑背衬上。
- 将片或卷状试纸精确切割成规定长度和宽度的试纸条。
- 控制膜、样品垫、结合垫和其他多孔介质上试剂铺展的一致性。
- 将试纸条放入塑料外壳中。
最大限度减少浪费并提高产量
最后，在设计检测方法和规划生产产品进程时，请通过以下步骤最大限度减少浪费并提高产量。
- 在规划过程中确保材料和试剂的批号规格匹配。
- 不断培训相关人员，确保制造工艺正确执行。
- 持续进行工艺在线检查，以确保子组件按照规格制造。
- 确保所选材料与制造机械兼容，以便在成品设备中实现预期性能。
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