人体骨骼肌细胞(HSkMC)培养方案

储存
培养物的制备
培养HSkMC
继代培养HSkMC
分化HSkMC

I. 储存

A. 低温贮藏瓶 （150-05a, 150-05f, S150-05a, S150-05f）

将细胞放入冻存管后须立即储存在液氮储罐中。

*从液氮储罐中取出冻存管时，请务必戴上面罩和手套。从液氮储罐到房间的剧烈温度变化可以导致冻存管中存留的任何液氮爆裂并造成人员受伤。

II.培养的准备工作。

1. 确保具有HEPA过滤层流的II级生物安全柜处于正常工作状态。
2. 用70％酒精对生物安全柜消毒。
3. 在开始细胞培养工作之前，打开生物安全柜风机10分钟。
4. 确保所有血清移液器、移液器吸头和试剂溶液都是无菌的。
5. 遵循标准灭菌技术和安全规则：
   a.    请勿用嘴吸移液。
   b.    在处理人体细胞时，请始终戴上手套和护目镜，即使所有菌株都已
         检测HIV、乙型肝炎和丙型肝炎为阴性，亦应有适当保护。
   c.    在无菌罩中进行所有细胞培养工作。

III.培养HSkMC

A. 为 HSkMC培养准备细胞培养瓶

1. 从冰箱中取出骨骼肌细胞培养基 (151-500)。在无菌超净台中用70％酒精给瓶子消毒。
2. 移取15mL骨骼肌细胞培养基 (151-500)*至T-75培养瓶(SIAL0641)中。
   *保持培养基与表面积的比例在每5 cm² 1 mL。
   例如：
   - 对T-25培养瓶（SIAL0639）或60 mm组织培养皿（SIAL0166）为5 mL。
   - 对T-75培养瓶（SIAL0641）或100 mm组织培养皿（SIAL0167）为15 mL。

B. 解冻和接种HSkMC

1. 在眼睛和手都有适当保护的情况下，从液氮储存箱取出冷冻保存的HUVEC小管。
2. 将瓶盖转动四分之一圈，以释放可能被困在螺纹中的液氮，然后重新拧紧瓶盖。
3. 将小管的下半部分放在37°C水浴中快速解冻细胞，并在解冻过程中密切观察小管。
4. 当小管中仅有少量冰时，从水浴中取出小管。请勿让细胞完全解冻。
5. 在无菌生物安全柜中用70％酒精对小管外部消毒。
6. 小心取下小管盖。请勿用手触摸盖子或小管的边缘，以免污染。
7. 用2 mL移液管轻轻吹5次，将细胞重悬于小管中。小心不要过于剧烈地移液以免起泡。
8. 用移液管从冻存管中取出细胞悬液（1 mL）并轻轻转移至装有15 mL内皮细胞生长培养基 (151-500)的T-75培养瓶 (SIAL0641)中。
9. 盖上培养瓶并轻轻摇动，使细胞均匀分布。
10. 将T-75培养瓶(SIAL0641) 放在37 °C、5% CO₂加湿培养箱中。松开盖子以便换气。为获得最佳结果，接种后24小时之内不要扰动培养物。
11. 24小时后或过夜后，更换新鲜的 骨骼肌细胞培养基 (151-500)以去除残留的DMSO。
12. 每隔一天更换骨骼肌细胞培养基 (151-500)，直至细胞达到60%融合。
13. 当培养细胞融合率达到60%以上或周末无换液培养时，将骨骼肌细胞培养基 (151-500)用量加倍。
14. 当HPAd培养达到85-95%融合时，进行细胞传代培养。

IV.HSkMC的传代培养

A. 准备传代试剂

1. 从-20°C冰箱中取出胰蛋白酶-EDTA溶液(T3924)和胰蛋白酶抑制剂(T6414) ，并在冰箱中解冻一夜。
2. 确保解冻所有传代培养试剂。轻轻旋转每个瓶子几次，形成均匀的溶液。
3. 将所有传代培养试剂储存在4°C以备将来使用。
4. 等分胰蛋白酶/EDTA溶液(T3924) ，如果只需要一部分胰蛋白酶/EDTA(T3924)，则将未使用的部分保存在-20°C。

B. 准备培养瓶

1. 从冰箱中取出骨骼肌细胞培养基 (151-500)。在无菌超净台中用70％酒精给瓶子消毒。
2. 移取35 mL骨骼肌细胞培养基(151-500) 至T-175培养瓶中 (SIAL1080) 中(将用于第IV C部分第15步。)

C. HSkMC的传代培养

在室温下对细胞进行胰蛋白酶消化。请勿将任何试剂加热至37°C。

1. 从培养瓶吸取培养基。
2. 用HBSS(H6648)洗涤单层细胞，吸除溶液。
3. 取5 mL胰蛋白酶/EDTA溶液(T3924)置于T-75培养瓶(SIAL0641)中。轻轻摇动培养瓶以确保溶液覆盖所有细胞。
4. 立即吸取4 mL的溶液。
5. 重新盖紧培养瓶盖子，并在倒置显微镜下在室温下监测胰蛋白酶消化过程。细胞通常需要2至5分钟才能变圆。细胞在胰酶消化过程中可能不会完全变圆，并且有些细胞可能会在脱离培养表面后依然处于消化进程中。
6. 用手掌拍打培养瓶侧面，使圆细胞从培养表面释放，直至大部分细胞脱落。
7. 将5 mL胰蛋白酶抑制剂溶液(T6414)移液至培养瓶，以抑制进一步的胰蛋白酶活动。
8. 将细胞悬浮液从培养瓶转移至50 mL无菌锥形管中。
9. 用另外的5 mL胰蛋白酶抑制剂溶液(T6414) 冲洗培养瓶，并将溶液转移到同一个锥形管中。
10. 在显微镜下观察T-75培养瓶(SIAL0641)。如果培养瓶中剩余> 20％的细胞，请重复步骤2-9。
11. 将锥形管以220×g离心5分钟以沉淀细胞。
12. 从锥形管中吸取上清液而不扰动细胞沉淀。
13. 用手指轻弹锥形管的尖端以松开细胞沉淀。
14. 用移液管轻轻吹打细胞以分散细胞团块，使细胞重悬于5 mL骨骼肌细胞培养基 (151-500)中。
15. 用血细胞计数板或细胞计数器计数细胞。如想使细胞快速生长，则接种密度为10,000个细胞/cm²，如想使细胞进行常规传代培养，则则接种密度为5,000个细胞/cm²。

V. HSkMC分化

A. 准备细胞培养皿

1. 将胶原蛋白包被溶液 (125-50) 轻轻旋转几次，将溶液混合均匀。
2. 在无菌超净台中用70％酒精给瓶子消毒。
3. 为实验确定合适的HSkMC培养模式，如平皿或培养瓶。
4. 将胶原蛋白包被液(125-50)加入组织培养皿中，浓度为1 mL每10cm²培养皿表面积，于37oC培养两小时或室温过夜培养。
5. 在无菌超净台中，吸出胶原蛋白包被溶液(125-50)。
6. 采用杜氏磷酸缓冲液(D8537)清洗胶原蛋白包被表面两次。
7. 包被培养瓶可立即使用或置于4 °C保存最长2周。

A. 用于分化的HSkMC接种

1. 成人HSkMC的接种方法为32000每cm²，胎儿HSkMC的接种方法为20000每cm²，采用骨骼肌细胞培养基(151-500)。
2. 将细胞置于37_oC，5% CO2湿度培养箱中过夜培养，第二天进行诱导分化。

C. 分化HSkMC为肌管

1. 将用于分化的所需量的骨骼肌细胞分化培养基 (151D-250) 于 37 °C，5% CO₂湿度培养箱中预平衡2小时。
2. 从培养皿中吸走骨骼肌细胞培养基 (151-500)。在更换培养基时不要让细胞变干。
3. 加入适量体积的骨骼肌细胞分化培养基 (151D-250)，以1 mL每5cm²比例。
4. 将细胞置于骨骼肌细胞分化培养基 (151D-250)于37 37 °C,，在5% CO₂湿度培养箱中培养。
5. 隔天更换新鲜的骨骼肌细胞分化培养基 (151D-250)。
6. 多核肌管通常在3-4天内形成胎儿HSkMC，成人HSkMC在6-7天形成。